HPLC 法测定薏米中两种植物甾醇

商云帅，冯 梅，王 东，杨玉民,*

（1.吉林工商学院粮食学院，吉林 长春 130507；2.长春职业技术学院，吉林 长春 130033）

薏米又称薏苡仁，是薏苡去壳后的种仁，中国传统食药两用的植物，在欧洲被称为生命健康之禾，在日本被列为防癌健康食品，更享有世界禾本植物之王的美誉。薏米味道甘淡，属寒性，有利水渗湿、健脾止泻和排脓等功效[1-2]。薏米营养丰富，约含有65%碳水化合物，17%蛋白质，5%脂肪。除了三大能量物质之外，薏米还含有多种活性成分，其中植物甾醇的含量在同类植物中居高[3-4]。植物甾醇是一种营养价值高、生物活性强，与动物甾醇结构相似的植物类固醇物质。植物甾醇主要包括β-谷甾醇、菜油甾醇和豆甾醇等，呈片状或粉末状，为白色固体，不溶于水、酸或碱，溶于有机溶剂[5]。由于植物甾醇能够抑制吸收低密度脂蛋白胆固醇，对人体具有较强的抗炎作用，多被用于降低胆固醇的保健食品[6]。此外，植物甾醇对许多慢性病，如糖尿病、心血管疾病、肝炎等有良好的抑制性，也是重要甾体药物和维生素D3的生产原料[7-11]。但人体细胞无法内源合成植物甾醇，只能从植物性食物中获取，因此植物甾醇作为备受关注的食品功能性因子广泛应用在食品、医药等领域[12]。

植物甾醇只能从外源食物中获得，而薏米含有丰富的甾醇类化合物，研究薏米植物甾醇的提取及分析极有必要。目前植物甾醇的检测方法主要有气相色谱法、薄层色谱法、红外光谱分析法、紫外分光光度法、高效液相色谱法等[13-14]。其中薄层色谱法操作复杂、耗时长且溶剂使用量大；红外光谱分析法误差大、灵敏度低且对样品的纯度有较高的要求；紫外分光光度法只能测定总甾醇的含量，无法测定各甾醇单体的含量；气相色谱法前处理复杂，需进行衍生化预处理。高效液相色谱法不需衍生化可直接进样，方法快速准确、重复性好，目前应用较为广泛。张冬阳[15]对薏米中β-谷甾醇的提取、分离、纯化及其功能性进行研究，采用高效液相色谱法测定薏米中β-谷甾醇含量，方法具有灵敏度高、精密度高的特点，但局限于一种植物甾醇的测定，不适用于多种植物甾醇的分离。冯文欢等[16]建立了HPLC-UV 法测定植物甾醇中3 种甾醇单体含量的方法，该方法便捷准确，加标回收率好，但是存在样品局限性大、程序运行时间较长等问题。为建立多组分植物甾醇快速、简便、准确的高效液相色谱法，本研究以薏米为原料，采用超声辅助提取法提取薏米中豆甾醇和β-谷甾醇，进行方法学研究，通过优化流动相配比、柱温、流速等色谱条件，建立适合薏米中两种植物甾醇的定性定量分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

薏米：产地吉林省。

豆甾醇、β-谷甾醇标准品（纯品型），北京万佳首化生物科技有限公司产品；甲醇（色谱纯），美国Fisher公司产品。

1.1.2 仪器与设备

U3000 型高效液相色谱仪，KQ-500E 型超声波清洗机，SC-3610 型低速离心机，HH-6 型数显恒温水浴锅，GZX-9070MBE 型恒温干燥箱，FA2004N 型电子天平，JY7114 型粉碎机。

1.2 方法

1.2.1 薏米中两种植物甾醇提取的工艺流程

薏米干燥→研磨过筛→称量→加入有机溶剂→超声辅助提取→离心→取上清液水浴挥干溶剂→甲醇定容至10 mL→经0.22 μm 微孔滤膜过滤至进样小瓶→上机分析

1.2.2 操作要点

准确称取一定质量的薏米样品于离心管中，加入一定体积的提取溶剂，水浴超声提取后离心处理，将上清液置于恒温水浴锅中，待溶剂挥干后用甲醇将待测物质定容至10 mL，过0.22 μm 微孔滤膜后上机测定，计算薏米样品中豆甾醇和β-谷甾醇的提取量。

1.2.3 试验方案设计

试验从不同提取溶剂、料液比、溶剂浓度、提取温度、提取时间、提取次数6 个单因素进行研究。不同提取溶剂分别为甲醇、乙醇、乙腈和正丁醇，此时溶剂浓度为 90%、料液比为 1∶30（g/mL）、提取温度 45 ℃、超声提取 40 min、提取 1 次；料液比分别为 1∶10、1∶20、1 ∶30、1∶40、1∶50（g/mL），此时提取溶剂为 90%乙醇、提取温度45 ℃、超声提取40 min、提取1 次；溶剂浓度分别为60%、70%、80%、90%、100%，此时料液比为1∶10（g/mL）、提取溶剂为乙醇、提取温度 45 ℃、超声提取 40 min、提取 1 次；提取温度分别为 35、45、55、65 ℃，此时料液比为 1∶10（g/mL）、提取溶剂为 90%乙醇、超声提取40 min、提取1 次；提取时间分别为20、30、40、50、60 min，此时料液比为 1∶10（g/mL）、提取溶剂为90%乙醇、超声温度35 ℃、提取1 次；提取次数为1、2、3、4 次，此时料液比为 1∶10（g/mL）、提取溶剂为90%乙醇、超声温度35 ℃、超声提取50 min、提取1 次。

1.2.4 标准曲线的绘制

准备称取豆甾醇和β-谷甾醇标准品各5 mg（精确至0.000 1 g），分别置于50 mL 容量瓶中，然后分别加入适量甲醇后超声溶解，用甲醇定容至刻度，配制成标准浓度均为100 μg/mL 的豆甾醇标准储备液和β-谷甾醇标准储备液。分别准确吸取两种标准储备液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 至 5 mL 容量瓶，充分混匀后甲醇定容，配制成 10、20、30、40、50 μg/mL 的混合标准使用液，上机测试。豆甾醇和β-谷甾醇标准品溶液浓度在10～50 μg/mL 内呈线性关系，回归方程分别为y=0.049 8x+0.011 3、y=0.054x+0.062 2，相关系数分别为 0.999 6、0.999 9。

1.2.5 方法检出限

取1 μg/mL 的混合标准使用液，按优化后的色谱条件进样分析，3 倍信噪比即为方法检出限，计算得到豆甾醇和β-谷甾醇的方法检出限分别为0.270 μg/mL和 0.262 μg/mL。

1.2.6 数据处理

原始数据由赛默飞U3000 数据处理系统生成，试验数据运用Excel 2013 软件计算，图谱由Origin Pro 9.0软件生成。

2 结果与分析

2.1 高效液相色谱分析方法的建立

2.1.1 检测波长的确定

分别取 2 mL 浓度为 100 μg/mL 的豆甾醇和β-谷甾醇标准溶液移入10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，配制成浓度为20 μg/mL 的混合标准使用液，利用紫外分光光度计在190～540 nm 波长范围内进行全波长光谱扫描，得到最大吸收波长为208 nm。

2.1.2 流动相配比的确定

在柱温30 ℃、流速1.2 mL/min、检测波长208 nm条件下进行等度洗脱，考察不同配比流动相对两种甾醇分离效果的影响，结果如图1 所示。以100%甲醇作为流动相，目标峰分离效果好，基线平稳，峰型好，分析时间短，两种植物甾醇在11 min 内完全分离。单标和混标色谱图比对可知，豆甾醇保留时间为9.343 min、β-谷甾醇保留时间为10.212 min。以A(99%甲醇)-B(1%水) 为流动相，出峰时间延迟且基线发生小幅波动；以A(98%甲醇)-B(2%水)为流动相，出峰时间延迟，导致运行时间变长，基线不稳定；以A(97%甲醇)-B(3%水)为流动相，峰面积小、出峰慢，基线大幅波动。因此，以100%纯甲醇为流动相，分离效果最好，对两种植物甾醇分离有利。

2.1.3 柱温的确定

在100%甲醇作为流动相、流速1.2 mL/min、检测波长208 nm 条件下进行等度洗脱，考察不同柱温对两种甾醇分离效果的影响，结果如图2 所示。柱温分别为25、30、35、40 ℃，分析色谱图可知，柱温的变化对峰形、基线影响不大，差别在于柱温越高，保留时间越短。综合分离效果及能耗等因素，选择30 ℃作为分离柱温。

2.1.4 流速的确定

在100%甲醇作为流动相、柱温30 ℃、检测波长208 nm 条件下进行等度洗脱，考察不同流速对两种甾醇分离效果的影响，结果如图3 所示。流速分别为0.8、1.0、1.2、1.4 mL/min，分析色谱图可知，流速的变化对峰形、基线影响不大，差别在于流速越大，保留时间越短，但同时柱压也会增大。综合分析时间和溶剂成本，选择1.2 mL/min 作为分离流速。

2.1.5 色谱条件的确定

综合分析试验结果，确定测定两种植物甾醇的最佳色谱分离条件为：色谱柱（C18，4.6 mm×250 mm×5 μm），流动相100%甲醇，柱温 30 ℃，流速 1.2 mL/min，检测波长208 nm，进行等度洗脱。

2.2 薏米中两种植物甾醇提取

试验采用超声法提取薏米中的豆甾醇和β-谷甾醇，考察了提取溶剂、溶剂浓度、料液比、提取时间、提取温度和提取次数等因素对提取量的影响，不同试验条件下提取量结果如表1 所示。分析表1 数据可知，两种植物甾醇在薏米中均有检出，豆甾醇含量相对较低，β-谷甾醇含量相对较高。根据试验结果可知，随着料液比和提取温度的增大，两种植物甾醇提取量呈下降趋势；溶剂浓度和提取时间对两种植物甾醇提取量的影响呈现先升高后降低的变化；增加提取次数，提取量变化不大。综合分析确定，提取量高且提取温度低、提取时间短的最佳条件为：乙醇溶剂为90%，料液比 1∶10（g/mL），提取温度 35 ℃，提取时间 50 min，提取次数1 次。此条件下进行6 次平行试验验证，得到薏米中β-谷甾醇提取量平均值为18.53 mg/100 g，豆甾醇提取量平均值为1.49 mg/100 g。

为了考察方法的准确度和精密度，进行了低、中、高三个水平的加标回收试验，6 次平行试验结果如表2 所示。薏米中β-谷甾醇的加标回收率平均值为97.9%～101.2%，相对标准偏差RSD 为3.3%～7.5%。豆甾醇的加标回收率平均值为89.8%～92.5%，相对标准偏差RSD 为3.2%～8.4%。试验结果表明，该方法回收率良好，RSD 均小于10%，符合分析要求。

表1 不同提取条件试验结果Table 1 Experimental results at different extraction conditions

表2 加标回收试验结果(n=6)Table 2 Result of standard recovery tests(n=6)

3 结论

本试验建立了超声辅助提取-高效液相色谱法测定薏米中两种植物甾醇即豆甾醇和β-谷甾醇含量的方法。通过优化流动相配比、选择柱温及流速等试验，确定了以100%甲醇为流动相，流速1.2 mL/min，柱温30 ℃，检测波长208 nm 的最佳色谱条件。方法学试验表明，两种植物甾醇在10～50 μg/mL 内均呈良好的线性关系，相关系数分别为0.999 6、0.999 9。为充分提取薏米中的目标组分，采用超声辅助提取法进行了多个单因素的考察，确定以浓度为90%的乙醇为提取溶剂，料液比 1∶10（g/mL），35 ℃水浴超声 50 min提取1 次为最佳提取条件。样品经最佳提取条件进行前处理，按最优仪器条件测得β-谷甾醇提取量为18.53 mg/100 g，豆甾醇提取量为1.49 mg/100 g。该方法操作便捷，适用性强，能够同时满足充分提取和准确定量薏米中两种植物甾醇的要求。