正山小种精油大孔树脂吸附工艺优化及其抗氧化活性分析

何理琴 王彩楠 刘志彬 张 晨 张 雯 倪 莉

(1. 福州大学食品科学技术研究所，福建 福州 350108；2. 福建省食品生物技术创新工程技术研究中心，福建 福州 350108)

产自福建北部武夷山的正山小种是红茶的典型代表，具有浓郁的香气和丰富的滋味。目前对正山小种挥发性香气成分的研究已有多篇报道。例如，郭雯飞等[1]运用GC-MS对正山小种的香气组成进行探究，结果表明长叶烯、香叶醇、反式-2己烯醛、苯乙醛、α-萜品醇等是正山小种的主要成分。李健权[2]采用同时蒸馏萃取法提取不同产地的正山小种的香气成分，对其分析结果表明正山小种中醛类和醇类含量相差不大，其中香叶醇、3-甲基-丁醛、芳樟醇、2-甲基-丁醛、己醛以及水杨酸甲酯含量较高，是正山小种特征性香气成分。廉明等[3]对中国4种名优红茶挥发性成分进行分析，研究显示植醇、香叶醇、β-紫罗酮、二氢猕猴桃内酯、咖啡因和芳樟醇氧化物是正山小种的主要成分。以正山小种茶叶，或其加工下脚料为原料，浓缩富集这些正山小种的香气成分，将其制备成香气精油产品可扩大其使用范围，提高其使用效率及经济附加值，具备一定的市场潜力，但正山小种精油的开发目前还未见报道。

研究拟以正山小种作为原料，使用蒸馏法制备正山小种香气水，然后通过大孔树脂吸附其香气成分，之后使用乙醇进行解吸附，制备正山小种精油，最后使用GC-MS分析其挥发性香气成分，并评估产品的抗氧化活性。

1 材料与设备

1.1 材料与试剂

正山小种：产地武夷山；

正构烷烃C7～C40：美国O2si Smart Solutions公司；

2-辛醇：98.0%，德国Dr.Ehrensorfer公司；

二苯代苦味酰基自由基(DPPH)和2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)：上海源叶生物科技有限公司；

其他试剂：分析纯。

1.2 仪器与设备

集热式磁力搅拌器：DF-1型，金坛市鑫诺实验仪器厂；

紫外可见分光光度计：UV-2000型，日本HITACHI公司；

气相色谱仪：7890B型，美国安捷伦公司；

质谱仪：5977A型，美国安捷伦公司；

电子天平：BL150型，德国赛多利斯公司；

固相微萃取萃取头：50/30 μm DVB/CAR/PDMS型，美国Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 正山小种香气水的制备和大孔树脂的预处理 取100 g的正山小种茶叶，浸没于1 000 mL 沸水(95 ℃)2 min，然后用两层纱布过滤去除茶叶茶渣得到正山小种茶汤。茶汤冷却至室温后在55 ℃水浴上进行减压蒸馏(压力5 kPa)，收集冷凝液(约600 mL)，作为正山小种香气水，进一步使用大孔树脂吸附其香气成分。

经前期试验探索发现LX-8大孔树脂对正山小种香气成分具有较强的吸附及解吸附能力，因此选取LX-8大孔树脂用以制备正山小种香精。取150 mg LX-8大孔树脂置于烧杯中，加入300 mL 95%乙醇浸泡24 h使树脂充分溶胀。将充分溶胀的树脂材料装填于玻璃柱，并用2倍柱体积的乙醇(95%)清洗。然后用5%盐酸溶液浸泡6 h，再用蒸馏水清洗直至流出液pH呈中性，之后用5%氢氧化钠溶液浸泡6 h，再用蒸馏水清洗直至流出液pH呈中性。最后去除预处理好的大孔树脂材料备用。

1.3.2 正山小种精油的制备和香气成分含量的测定 使用大孔树脂静态吸附法制备正山小种香精。称取一定量经预处理好的树脂材料放入锥形瓶中，再分别加入一定体积上述制备好的香气水溶液，密封瓶口，置于25 ℃转速为200 r/min的恒温摇床振荡器中，振荡吸附一定时间，收集吸附液。

使用吸光值法粗略测定样品的香气成分含量。在波长200～380 nm范围内扫描样品的吸光值，并计算其积分，用以代表溶液中挥发性香气成分的浓度，并按式(1)和式(2)分别计算树脂的吸附率和吸附量。

(1)

(2)

式中：

A——吸附率，%；

S0——原液吸光值积分；

S1——吸附液吸光值积分；

Q——树脂吸附量，mL/g；

V——香气水体积，mL；

M——树脂干重，g。

1.3.3 正山小种挥发性香气成分的分析 使用顶空固相微萃取(HS-SPME)结合GC-MS技术分析正山小种精油各个制备阶段的样品[4]。样品的前处理和分析方法：量取5.9 mL样品于15 mL样品瓶中，加入2 g NaCl和100 μL 2-辛醇(内标浓度0.062 5 mL/L)，并将萃取头插入到样品瓶的顶空部分，立即置于50 ℃水浴中平衡10 min，之后推出纤维头进行顶空吸附，萃取时间为40 min。之后使用GC-MS分析样品。色谱条件：色谱柱HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 μm×0.25 mm)；升温程序：起始温度50 ℃，保持6 min，以2 ℃/min升温至90 ℃，再以3 ℃/min升温至180 ℃；进样口温度250 ℃；分流进样，分流比20∶1；溶剂延迟时间3 min；载气是He(99.999%)。质谱条件：离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；扫描模式：全扫描；质量扫描范围m/z30～550。挥发性物质的鉴定结果以NIST11谱库检索和保留指数共同鉴定[5]。

1.3.4 正山小种精油ABTS自由基清除率的测定 配制7 mmol/L的ABTS贮存母液及2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液，临用前以1∶1的体积比混合，室温避光放置16 h 后，用5 mmol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液稀释至于734 nm处吸光值为0.70±0.02，即ABTS自由基溶液。ABTS自由基溶液与不同浓度的样品以1∶1 (体积比)混合，室温避光反应10 min后，于734 nm下测定吸光值，磷酸盐缓冲液(5 mmol/L，pH 7.4)调零。空白组用95%酒精代替样品。按式(3)计算ABTS自由基清除率[6]。

(3)

式中：

SRABTS——ABTS自由基清除率，%；

A——空白组吸光值；

B——样品组吸光值。

1.3.5 正山小种精油DPPH自由基清除率的测定 分别取1.5 mL不同浓度样品溶液与1.5 mL DPPH溶液(0.02 mmol/L，95%乙醇配制)充分混匀，室温避光反应30 min于517 nm处测定其吸光值；样品参比组为1.5 mL 不同浓度的香精溶液与1.5 mL 95%乙醇溶液；空白组为1.5 mL DPPH溶液与1.5 mL 95%乙醇溶液。按式(4)计算DPPH自由基清除率[6]。

(4)

式中：

SRDPPH——DPPH自由基清除率，%；

A——样品组吸光值；

B——样品参比组吸光值；

C——空白组吸光值。

1.3.6 数据分析 试验数据采用平均值±标准差表示，并使用SPSS 22.0统计分析软件中的Duncan's ANOVE(P<0.05)对试验数据进行显著性分析。

2 结果与讨论

2.1 大孔树脂吸附法制备正山小种精油工艺优化

使用蒸馏法制备正山小种香气水后，利用大孔树脂吸附正山小种香气成分，并通过乙醇洗脱制备正山小种精油。前期试验对比了12种大孔树脂(HPD722、DM-130、AB-8、D101、HZ816、LSA-40、DM301、HPD750、LSA-8、LX-8、HPD100、HPD950)对正山小种香气水的吸附量和解吸附量，发现LX-8大孔树脂对正山小种香气成分具有较强的吸附及解析附能力，因此选取LX-8大孔树脂用以制备正山小种香精。进一步对LX-8大孔树脂的使用量，吸附时间以及乙醇洗脱时间进行优化。大孔树脂对正山小种香气成分吸附和解吸附的效果使用吸光值法进行粗略判断，试验结果如下。

2.1.1 LX-8大孔树脂使用量的优化 对比不同LX-8大孔树脂的使用量在恒温摇床振荡器(25 ℃，转速200 r/min)中吸附3 h对350 mL正山小种香气水的吸附效果，试验结果如图1所示。

图1 LX-8大孔树脂不同使用量对香气成分吸附率的影响

由图1可知：大孔树脂对香气成分的吸附率随树脂使用量的增加而逐渐升高，在树脂含量提高到1.0 g以后吸附量趋于平缓。综合考虑大孔树脂的使用量和香气成分的吸附率，选取1.0 g LX-8大孔树脂处理350 mL正山小种香气水。该使用量下，大孔树脂对正山小种香气成分的吸附率为77.3%。

2.1.2 LX-8大孔树脂吸附时间的优化 取1.0 g LX-8大孔树脂在恒温摇床振荡器(25 ℃，转速200 r/min)中对350 mL正山小种香气水进行吸附，对比不同吸附时间下大孔树脂对香气成分的吸附量，试验结果如图2所示。

由图2可知：LX-8大孔树脂对香气成分的吸附量随吸附时间的增加而增加，吸附150 min前，LX-8大孔树脂吸附量迅速增加，之后趋缓。吸附180 min后基本达到吸附平衡，综合考虑大孔树脂对香气成分的吸附量，选取180 min作为LX-8大孔树脂的最佳吸附时间。

图2 LX-8大孔树脂不同吸附时间对香气成分吸附量的影响

2.1.3 LX-8大孔树脂正山小种香气解吸附时间与次数的优化 将1.0 g充分吸附后的大孔树脂通过抽滤法去除吸附液，并用蒸馏水洗涤3次，然后加入5 mL 95%乙醇在恒温摇床振荡器(25 ℃，转速200 r/min)震荡对香气成分进行解吸附，对比不同解吸附时间对正山小种香气成分的解吸附效果，结果见图3。

图3 不同解吸附时间对香气成分解吸附效果的影响

由图3可知：当解吸附时间为150 min时获得最高香气成分浓度的正山小种香精，提高吸附时间无法进一步获得更高浓度的香精产品。因此选取150 min作为LX-8大孔树脂的最佳解吸附时间。解吸附条件为：1.0 g LX-8已吸附香气成分的大孔树脂使用5 mL 95%乙醇在恒温摇床振荡器(25 ℃，转速200 r/min)震荡解吸附150 min。该解吸附条件下获得的正山小种香精香气成分浓度是香气水香气成分浓度的约35倍，香气成分的回收率约51%。

2.2 GC-MS分析正山小种精油的组成成分

由于正山小种精油中乙醇是最主要的成分，在使用GC-MS直接分析正山小种精油样品过程中，乙醇的峰掩盖了大量其他挥发性香气成分，无法获得有意义的数据。

因此使用GC-MS对正山小种茶汤、正山小种香气水及大孔树脂吸附后的残留吸附液的挥发性香气成分进行定性及定量分析，从而间接分析正山小种精油的香气成分。

由表1可知，在正山小种茶汤、香气水及大孔树脂残留吸附液中分别检测出52、43和11种挥发性香气成分，其总含量分别为(6.862±0.142)，(5.984±0.080)，(0.491±0.042) μL/L。蒸馏法所获得的正山小种香气水保留了绝大部分正山小种中的挥发性香气成分，提取率约为87.2%。大孔树脂吸附后所残留的吸附液所含有的挥发性香气成分较少，绝大部分被大孔树脂所吸附，吸附率约为91.8%。其中正山小种中的特征性香气成分基本被完全吸附，例如正山小种特征性香气成分顺式芳樟醇氧化物、芳樟醇、苯乙醇、芳樟醇氧化物、香叶醇等在残留吸附液中含量极低。因此，正山小种香气水中的特征香气成分在被充分提取之后能够被大孔树脂吸附，并制备成精油。该间接法初步说明了大孔树脂吸附法可以用于制备具有正山小种特征香气成分的精油产品。

表1 正山小种茶汤、香气水及其大孔树脂吸附液的挥发性香气成分

续表1

2.3 正山小种精油抗氧化活性测定

使用95%乙醇稀释正山小种精油，采用ABTS自由基清除率和DPPH自由基清除率评估所制备正山小种精油的抗氧化性，结果如图4所示。

由图4可知：该正山小种精油的DPPH自由基和ABTS自由基清除率随精油稀释倍数的提高呈递减趋势。

图4 正山小种精油的抗氧化活性

稀释20倍后，该正山小种精油的DPPH自由基清除率为39.1%；稀释25倍后，正山小种精油的ABTS自由基清除率仍有29.5%。对比抗坏血酸的DPPH自由基和ABTS自由基清除率可知，该正山小种精油的DPPH自由基清除活力为4 μg/mL抗坏血酸当量；ABTS自由基清除活力为3 μg/mL抗坏血酸当量。

茶叶中的抗氧化成分主要认为是多酚类物质[7-9]，试验结果表明，正山小种的挥发性香气成分也具有一定的抗氧化活性，是一种潜在的天然抗氧化剂。Yu等[10]探究了6种不同来源的老鹰茶挥发油的抗氧化活性，结果表明这些挥发油均有一定的抗氧化和抗菌特性；田光辉等[11]研究发现新鲜茶叶挥发油和加工后新茶的挥发油对OH自由基均有清除作用，而新鲜茶叶挥发油对OH自由基有较强的清除作用；Yanagimoto等[12]探究了绿茶、乌龙茶、红茶挥发性成分的抗氧化活性，发现绿茶挥发性成分的抗氧化活性最好。

3 结论

试验以正山小种为原料，通过大孔树脂吸附法制备了正山小种精油，优化了制备工艺。以该优化工艺所制备的正山小种精油具备典型的正山小种的香气特征，香气成分的浓缩倍数为35，回收率约为51%，并且具备一定的抗氧化活性。但该方法的整体香气回收率还有待提高；或者也可通过开发以正山小种加工下脚料为原料制备精油的方法，以降低精油的生产成本。