真空冷冻干燥对菊花多酚含量及其抗氧化活性的影响

余欣珂 明 建,2 支 玲 李苇舟 闫慧明 王启明 赵吉春

(1. 西南大学食品科学学院，重庆 400715；2. 食品科学与工程国家级实验教学示范中心〔西南大学〕，重庆 400715)

菊花是菊科植物菊(ChrysanthemummorifoliuinRamat.)的干燥头状花序，既是观赏花卉，也是药食同源植物[1-2]。菊花还含有大量抗氧化物质，具有抗氧化[3]、抗衰老耐疲劳[4-5]、保护心血管[6]、调血脂[7]、抗肿瘤[8]等作用，其抗氧化物质主要为酚类化合物及其衍生物[9-12]。王婷婷等[13]研究发现，不同品种菊花的抗氧化活性有一定差异。近年来，关于菊花黄酮的研究较多，而有关菊花多酚抗氧化活性的研究较少[14]。

新鲜菊花含水量高达80%以上，极难保存[15]。常用的干燥方法有阴凉干燥、热风干燥、微波干燥、真空冷冻干燥等。阴凉干燥成本低，但干燥周期长，效率低；热风干燥过程中菊花中的热敏性成分会因温度过高而使含量降低甚至失活，降低菊花的药用价值；微波干燥具有效率高、速度快等优点，但微波功率的升高和加热时间的延长可能导致某些热敏性成分吸收大量微波而被破坏[16]。而真空冷冻干燥(简称冻干)过程在低温以及真空状态下进行，避免了热敏反应以及氧化作用，能有效保存新鲜食品的色、香、味以及营养成分[17]。作为一种新型干燥技术，真空冷冻干燥主要应用于果蔬[18]、水产[19]、菌种[20]等加工方面。试验拟选用4种市售菊花为原料，借助真空冷冻干燥技术，通过测定多酚含量、DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力、铁还原能力以及氧自由基吸收能力(ORAC)，比较4种菊花冻干前、后多酚含量及抗氧化活性的差异，为菊花的综合利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

金丝皇菊(Dendranthemamorifolium〔Ramat.〕Tzvel.)、贡菊(FloristsChrysanthemum)：采自重庆市渝北区；

雏菊(BellisperennisL.)：采自江苏省苏州市；

杭白菊(Chrysanthemummorifolium'Hangju')：采自浙江省桐乡市；

丙酮、浓盐酸、氢氧化钠、正己烷、乙酸乙酯、碳酸氢钠、铁氰化钾、三氯化铁、抗坏血酸等：分析纯，成都科龙化工试剂厂；

福林—酚试剂、水溶性VE(Trolox)、DPPH、ABTS、荧光素钠盐(FL)：分析纯，美国Sigma公司；

2,2’-偶氮二异丁基脒盐酸盐(ABAP)：分析纯，日本Wako公司。

1.1.2 主要仪器设备

旋转蒸发仪：RE-52AA型，上海亚荣生化仪器厂；

循环水真空泵：SHZ-Ⅲ型，上海亚荣生化仪器厂；

中草药粉碎机：FW177型，天津泰斯特仪器有限公司；

电热恒温鼓风干燥箱：DHG-9140A型，上海齐欣科学仪器有限公司；

分光光度计：JH722型，上海精科科学仪器厂；

多功能酶标仪：Spectra Max M2型，美国Molecular公司。

1.2 方法

1.2.1 原料预处理 将4种菊花置于-40 ℃冰箱内贮藏，作为鲜样备用。参照刘鸿雁等[21]的方法并适当调整。将4种菊花置于真空冷冻干燥机内预冻2 h，升华干燥32 h，再以35 ℃的加热搁板温度进行解析干燥8 h，得冻干后的样品(简称干样)，粉碎，过60目筛，分袋真空包装，置于干燥器中保存。

1.2.2 含水量测定 按GB 5009.3—2010执行。

1.2.3 多酚的提取

(1) 游离酚：参照文献[22]。

(2) 结合酚：参照文献[23]。

1.2.4 多酚含量测定 采用Folin-Ciocalteau比色法[24]。以没食子酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=0.003 9x+0.031 8(R2=0.997 6)，计算菊花样品中多酚含量，并以每克样品干物质中所含的没食子酸当量(mg GAE/g·DW)表示。按式(1)计算鲜样和干样多酚含量比值。

(1)

式中：

DW——干样，g;

FW——鲜样，g;

ω1——干样含水量，%;

ω2——鲜样含水量，%。

1.2.5 抗氧化活性测定

(1) DPPH·清除率：参照文献[25]，按式(2)计算菊花DPPH·清除率。

(2)

式中：

K——自由基清除率，%;

Ai——样液吸光度；

Aj——试剂空白吸光度。

(2) ABTS+·清除率：参照文献[26]，按式(2)计算菊花ABTS+·清除率。

(3) 铁还原力：参照文献[27]。

(4) 氧自由基吸收能力：参照文献[28]。按式(3)、(4)分别计算荧光衰减曲线下的面积(AUC)和ORAC值，ORAC值以每克样品干物质中所含Trolox当量(μmol TE/g·DW)表示。

AUC=

(3)

(4)

式中：

f1——第1次荧光读数值；

fi——第i次荧光读数值；

CT——间隔测定时间，4.5 min；

ρTrolox——Trolox质量浓度，mg/mL；

ρ样品——样品质量浓度，mg/mL；

AUC样品——样品荧光衰减下的面积；

AUC空白——空白液荧光衰减下的面积。

1.3 数据处理

所有试验重复3次，结果表示为平均值±标准偏差。采用Excel 2016软件进行数据统计分析，采用SPSS 21.0软件进行数据处理，并采用单因素ANOVA分析、Duncan多重比较(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 含水量变化

4种菊花冻干前后含水量变化显著(P<0.05)，其中金丝皇菊的含水量变化最大，冻干后含水量最低(表1)。

表1 4种菊花真空冷冻干燥前后含水量†

2.2 多酚含量变化

由表2可知，4种菊花冻干前后多酚含量变化显著(P<0.05)，与闫旭等[29-30]的研究结果相似。冻干后游离酚和总酚含量均显著升高(P<0.05)，较冻干前分别提升了1.617～3.918倍和1.331～2.525倍，且游离酚为主要存在形式。其中，雏菊游离酚和总酚含量增幅最大(分别为3.918倍和2.525倍)。而冻干后结合酚含量均显著降低(P<0.05)，较冻干前降低了1.470～2.517倍，其中杭白菊结合酚的降幅最大(2.517倍)，可能是因为真空和低温条件抑制了植物细胞的呼吸作用，抑制了多酚氧化酶的活性，阻止了多酚向醌类物质转化[31-32]；且冻干时间适当，细胞内的水分被冻结成大量细小冰晶，破坏了共价键和疏水键，使得与蛋白质、糖类等高分子化合物结合的多酚释放出来，结合酚向游离酚转变，更好地与有机溶剂接触[33]，从而提高了总酚和游离酚含量，降低了结合酚含量。

表2 4种菊花真空冷冻干燥前后多酚含量†

2.3 清除DPPH·能力比较

由图1可知，菊花冻干后游离酚清除DPPH·的能力均显著提高(P<0.05)，金丝皇菊、贡菊、雏菊、杭白菊4种菊花冻干后IC50值显著下降(下降幅度依次为62.787%，31.341%，71.399%，50.304%)(P<0.05)，冻干后4种菊花之间的游离酚清除DPPH·能力差异不显著，且清除力均高于抗坏血酸。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

由图2可知，菊花冻干后结合酚清除DPPH·的能力显著改变，贡菊、雏菊、杭白菊的IC50值显著上升(上升幅度依次为16.118%，62.579%，29.197%)(P<0.05)，表明这3种菊花冻干后结合酚清除DPPH·的能力显著下降，金丝皇菊冻干后IC50值下降，表明其结合酚清除DPPH·的能力提高，但与冻干前差异不显著。除金丝皇菊外，其余3种菊花冻干后结合酚清除DPPH·的能力均低于抗坏血酸。冻干后4种菊花间的结合酚清除DPPH·的能力差异显著(P<0.05)，其清除能力顺序为金丝皇菊>贡菊>杭白菊>雏菊。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

综上，菊花冻干后游离酚清除DPPH·的能力均增强，结合酚清除DPPH·的能力变化略有差异，但普遍降低。其中，雏菊冻干后游离酚清除DPPH·能力最强(IC50值为22.388 μg/mL)，金丝皇菊冻干后结合酚清除DPPH·能力最强(IC50值为29.948 μg/mL)。

2.4 清除ABTS+·能力比较

由图3可知，菊花冻干前后游离酚清除ABTS+·的能力差异不显著，4种菊花之间的差异也不显著，冻干前后清除ABTS+·能力均高于抗坏血酸。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

由图4可知，雏菊冻干后IC50值显著上升(上升幅度为20.547%)(P<0.05)，表明雏菊冻干后结合酚清除ABTS+·的能力显著下降；贡菊冻干后IC50值显著下降(下降幅度为35.536%)(P<0.05)，表明贡菊冻干后结合酚清除ABTS+·的能力显著上升；金丝皇菊和杭白菊冻干前后结合酚清除ABTS+·的能力差异不显著。4种菊花冻干前后结合酚清除ABTS+·的能力均强于抗坏血酸。冻干后金丝皇菊与杭白菊间结合酚清除ABTS+·的能力差异不显著，但与另外两种菊花的差异显著(P<0.05)。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

综上，菊花冻干后游离酚清除ABTS+·的能力变化不显著，但均强于抗坏血酸。菊花冻干后结合酚清除ABTS+·的能力变化有差异，其中贡菊的清除能力显著增强(IC50值为2.010 μg/mL)，雏菊的清除能力显著降低(IC50值为3.391 μg/mL)，而金丝皇菊和杭白菊与冻干前的差异不显著。

2.5 铁还原能力比较

由图5可知，菊花冻干后游离酚的铁还原能力均显著提高，金丝皇菊、贡菊、雏菊、杭白菊4种菊花冻干后IC50值显著下降(下降幅度依次为31.003%，18.730%，29.420%，45.549%)(P<0.05)，但铁还原能力均低于抗坏血酸。金丝皇菊冻干后游离酚的铁还原能力与其他3种菊花的差异显著(P<0.05)，贡菊、雏菊、杭白菊之间游离酚的铁还原能力差异不显著。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

字母不同表示差异显著(P<0.05)

由图6可知，菊花冻干后结合酚铁的还原能力变化显著，贡菊、雏菊、杭白菊的IC50值显著上升(上升幅度依次为28.181%，65.007%，19.744%)(P<0.05)，表明这3种菊花冻干后结合酚的铁还原能力显著下降，金丝皇菊冻干后IC50值下降，其结合酚的铁还原能力提高，但与冻干前差异不显著。金丝皇菊冻干后结合酚的铁还原能力与其他3种菊花的差异显著(P<0.05)。

综上，菊花冻干后游离酚的铁还原能力均增强，结合酚的铁还原能力变化略有差异，除金丝皇菊外，其余3种菊花的铁还原能力降低。其中，杭白菊冻干后游离酚的铁还原能力最强(IC50值为61.158 μg/mL)，金丝皇菊冻干后结合酚的铁还原能力最强(IC50值为52.492 μg/mL)。

2.6 氧自由基吸收能力比较

由图7可知，菊花冻干后游离酚的ORAC显著提高，贡菊、雏菊、杭白菊的ORAC值显著升高(上升幅度依次为88.198%，326.283%，256.306%)(P<0.05)。金丝皇菊冻干后游离酚的ORAC虽提高，但与冻干前差异不显著。贡菊冻干后游离酚的ORAC与其他3种菊花的差异显著(P<0.05)。

由图8可知，菊花冻干后结合酚的ORAC显著下降，贡菊、雏菊、杭白菊的ORAC值显著下降(下降幅度依次为43.958%，60.494%，86.117%)(P<0.05)。金丝皇菊冻干后结合酚的ORAC虽下降，但与冻干前差异不显著。金丝皇菊冻干后与雏菊、杭白菊之间结合酚的ORAC差异显著(P<0.05)。

综上，菊花冻干后游离酚的ORAC呈上升趋势，其中杭白菊的ORAC最高(870.876 μmol TE/g·DW)。菊花冻干后结合酚的ORAC呈下降趋势，其中杭白菊的ORAC最低(27.872 μmol TE/g·DW)。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.7 多酚含量与抗氧化能力的相关性分析

由表3可知，ORAC与冻干前游离酚含量呈极显著相关性(P<0.01)，与冻干前结合酚含量呈显著相关性(P<0.05)，与Zheng等[34]的结论相似。而其他3种抗氧化能力与多酚含量的相关性不显著，但发现多酚含量的变化与抗氧化性的强弱是相关的[35]。这是因为测量抗氧化能力的方法、反应机制不同可能导致不同的观察结果[36]。此外，菊花中的各种天然抗氧化成分往往具有协同作用，使得多酚含量相似的样品抗氧化能力不同，4种菊花在冻干前后具有抗氧化活性的酚类的种类和含量也不同。这些因素都影响着多酚含量与抗氧化能力的相关性。所以冻干后游离酚含量增加，且真空低温条件抑制了多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)等的活性，使得冻干后游离酚清除DPPH·能力、铁还原能力、ORAC普遍增强。而冻干后结合酚含量降低，导致其清除DPPH·能力、铁还原能力、ORAC变化普遍降低。而清除ABTS+·能力差异不显著，可能是因为影响清除ABTS+·能力的单体酚在冻干前后含量基本没有变化。后续还需进一步研究多酚的组成对抗氧化活性的影响。

表3 多酚含量与抗氧化能力的相关性分析†

3 结论

以4种市售菊花为原料，借助真空冷冻干燥技术，分析了菊花冻干前后多酚含量、组分及抗氧化活性的变化。结果表明，4种菊花冻干前总酚含量为8.479～16.571 mg GAE/g·DW，冻干后总酚含量为16.340～32.717 mg GAE/g·DW，游离酚是菊花冻干前后多酚的主要存在形式(占53.690%～90.681%)。4种菊花冻干前后均具有一定的抗氧化活性，冻干后游离酚的抗氧化性普遍增强，结合酚的抗氧化性普遍降低。清除DPPH·能力的IC50值为24.292～79.829 μg/mL，清除ABTS+·能力的IC50值为2.010～3.391 μg/mL，铁还原能力的IC50值为44.138～125.570 μg/mL，ORAC值为27.872～870.876 μmol TE/g·DW。菊花富含多酚且具有较强的抗氧化活性，是植源性多酚的优良来源之一，真空冷冻干燥后的总酚含量增加。后续可进一步探索真空冷冻干燥的参数，减少能耗，研究多酚组分对抗氧化活性的影响，以及对其细胞和体内抗氧化能力进行研究并探讨其作用机制。