肌萎缩侧索硬化患者脑脊液及血清中巨噬细胞炎性蛋白-1α水平的临床研究

杨璇，臧大维

肌萎缩侧索硬化(ALS)是一种进展性、致命性的神经系统退行性疾病，主要影响上、下运动神经元，导致患者肌无力、肌萎缩、肌束颤动等，大多数患者在诊断2～5年内由于呼吸道感染、褥疮、呼吸肌麻痹等并发症而死亡，至今仍缺乏有效的的诊断及治疗方法。近年来，越来越多的研究者关注ALS的生物标志物研究，从而深入了解其发病机制，帮助早期诊断及治疗。生物标志物在基因、蛋白质及代谢产物等领域发展迅速，尤其是细胞因子和趋化因子的研究，比如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)[1]、血管内皮生长因子(VEGF)[2]、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)[3]等被认为在ALS某些阶段发挥重要作用。巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)是CNS炎症反应中最常见的趋化因子之一，是CC类趋化因子的成员之一，又被称为CC趋化因子配体3(CCL3)，它通过激活其受体CCR1和CCR5发挥作用[4]。MIP-1α是促炎性趋化因子，其关键功能是促进白细胞聚集至炎症部位。目前MIP-1α已被证明不仅与CNS自身免疫性疾病相关，还与Alzheimer’s病、帕金森病、创伤性脑损伤等炎症机制相关的疾病存在关联[5-8]。既往研究发现ALS患者CSF中MIP-1α水平明显升高[9]，但MIP-1α与疾病进展及预后的潜在关系尚不清楚。本研究旨在明确ALS患者CSF及血清MIP-1α水平是否升高，并探讨MIP-1α水平与各项临床指标，如病程、疾病进展率、神经功能缺损评分及生存预后的关系。

1 对象与方法

1.1 对象 纳入2006年10月至2017年10月就诊于我院门诊及住院的ALS患者共70例为ALS组，其中男性36例，女性34例，平均年龄为(56.86±9.49)岁，平均病程为(27.10±25.35)个月。ALS患者均由临床经验丰富的神经内科医师依据修订的 EI Escorial ALS临床诊断标准[10]明确诊断。排除标准：合并严重的心、肝、肾功能损害者、呼吸衰竭、严重的肺感染的患者；合并脑卒中病史、糖尿病周围神经病变及任何损害运动神经元而可能混淆 ALS 诊断的疾病患者；纳入病例组时正在服用任何药物的患者。纳入同期住院的非炎症性神经系统疾病患者作为对照组，包括低颅压头痛、CSF漏等。对照组患者共51例，其中男性24例，女性27例，平均年龄为(56.94±10.17)岁。排除标准：合并严重的心、肝、肾功能损害者、呼吸衰竭、严重的肺感染的患者；正在服用任何药物，尤其是抗炎药物的患者。本研究由医院伦理委员会批准，所有入组患者均签署实验知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 ALS患者评估及随访方法 通过改良版ALS功能评分量表(ALSFRS-r)对ALS患者的神经功能缺损情况进行评估，ALSFRS-r量表总分48分，得分越高，说明ALS患者整体神经功能受损越轻微，反之则患者神经功能缺损越严重。应用疾病进展率(DPR)评估ALS患者的疾病进展情况，计算公式为：DPR=48-诊断时ALSFRS-r评分/病程(月)，DPR值越大，疾病进展越快，反之则疾病进展越缓慢。此外，本研究通过电话或门诊成功随访入组ALS患者48例，详细记录其生存状态。

1.2.2 标本采集 应用标准的腰椎穿刺术留取70例ALS患者及51例对照组患者的CSF，并立即离心和分装上清液，置于-80 ℃冰箱保存待检。所有入组的患者于空腹行静脉穿刺术抽取非抗凝血，离心并分装上层血清，置于-80 ℃冰箱保存待检。所有标本均在6个月内检测完毕。

1.2.3 ELISA法检测MIP-1α水平 CSF及血清中MIP-1α水平由ELISA检测，所使用的MIP-1α ELISA测试剂盒购于美国R&D公司，具体方法严格按照说明书进行。本研究所有标本检测均做复孔，取平均值为研究数据。

2 结 果

2.1 ALS患者和对照组人口学特征及临床评估数据的比较 见表1。

表1 ALS组和对照组基本临床资料的比较(x±s)项目ALS组对照组例数7051性别 (男/女)36/3424/27年龄 (岁)56.86±9.4956.94±10.17标本例数 (CSF/血清)49/7051/51首发部位 肢体46- 延髓15-两者均有9-体质量指数(BMI)23.99 ±3.68-病程 (个月)27.10±25.35-ALSFRS-r评分35.49±6.00-DPR0.78±0.67-

2.2 ALS组和对照组患者MIP-1α水平的比较 ALS组CSF的MIP-1α水平[(303.97±50.46)pg/ml]明显高于对照组[(181.39±59.87)pg/ml](P<0.05)，ALS组血清MIP-1α水平[(346.80±65.98)pg/ml]明显高于对照组[(186.51±45.07)pg/ml](P<0.05)。

2.3 ALS组MIP-1α水平与临床指标的相关性分析

ALS组CSF中MIP-1α与病程呈正相关(r=0.5070，P=0.0002)，与DPR呈负相关(r=-0.4760，P=0.0005)，与ALSFRS-r评分无明显相关性(r=0.0260，P=0.8600)；ALS组血清MIP-1α与病程呈正相关(r=0.4270，P=0.0002)，与DPR呈负相关(r=-0.490，P<0.0001)，与ALSFRS-r评分无明显相关性(r=0.0530，P=0.6630)。

2.4 MIP-1α水平对ALS患者的累积生存分析 见图1。本研究成功随访入组ALS患者48例，根据血清MIP-1α水平，将MIP-1α水平高于中位数(≥346.80 pg/ml)患者定义为H group，低于中位数定义为L group。Kaplan-Meier生存分析显示，MIP-1α水平高于平均值的ALS患者，其累积生存率明显高于MIP-1α水平低于平均值的ALS患者(P=0.0031)。

图1 MIP-1α水平对ALS患者的累积生存分析

2.5 ALS患者生存预后影响因素的Cox多因素分析

见表2。将性别、年龄、首发部位、BMI、病程、DPR、ALSFRS-r评分、血清中MIP-1α水平、CSF中MIP-1α水平纳入Cox多因素分析模型，结果显示，血清MIP-1α水平是ALS患者生存预后的影响因素。

表2 ALS患者生存预后影响因素的Cox多因素分析影响因素OR值95%CIP值性别1.2750.370～4.4000.700年龄1.0390.982～1.0990.180首发部位 肢体1 延髓2.4270.554～10.6410.240 二者均有2.2510.296～17.1170.433BMI1.1490.970～1.3610.109病程0.9540.893～1.0190.161ALSFRS-r评分0.9440.834～1.0700.368DPR0.9050.287～2.8530.864血清中MIP-1α水平0.9800.969～0.9910.001CSF中MIP-1α水平0.9940.977～1.0110.510

3 讨 论

本研究应用ELISA检测血清和CSF中MIP-1α的水平，分析MIP-1α与ALS患者各项临床指标及生存预后的关系。主要结果如下：(1)ALS患者MIP-1α的水平较对照组明显升高；(2)ALS患者的MIP-1α水平与病程呈明显正相关，与疾病进展率呈明显负相关；(3)MIP-1α水平高于平均值的ALS患者，其累积生存率明显高于MIP-1α水平低于平均值的ALS患者；(4)Cox多因素分析结果显示，血清MIP-1α水平是ALS患者生存预后的影响因素。以上研究结果提示，MIP-1α水平越高，ALS患者的病程越长，疾病进展率越低，进展越缓慢，累积生存率也越高，MIP-1α可能是预测疾病进展及生存预后的生物标志物之一。

MIP-1α对于诱导小胶质细胞聚集至关重要，而这种活化的小胶质细胞会诱导炎症反应，并在多种炎症因子的合成和释放中发挥重要作用[11-13]。近年来，CNS炎症反应被认为是ALS发病的关键机制之一[14]。当ALS患者的炎症机制启动，炎症介质的释放会增加，MIP-1α作为最常见的炎症趋化因子，必然会明显升高并参与到机体炎症反应中。

MIP-1α是一种促炎性趋化因子，曾有研究认为这种促炎性趋化因子对机体发挥有害的影响。Tonges等[15]将MIP-1α作为一种研究指标去评估 ROCK 抑制剂法舒地尔对ALS的神经保护作用，若法舒地尔干预后，MIP-1α等一系列促炎性因子水平降低，则说明法舒地尔对 ALS 具有一定的治疗效果，故研究者们将MIP-1α作为有害因子去评估药物的疗效。此外，有研究发现 MIP-1α可能会加速Alzheimer’s病患者非认知功能症状的进展[16]。

然而本研究结果显示，MIP-1α水平越高，ALS患者的病程越长，疾病进展率越低，疾病进展越缓慢，累积生存率也越高。面对不同研究结果的差异，分析如下：首先，MIP-1α在ALS发病机制中可能发挥双向的炎性作用，它可能在疾病早期参与炎症反应，并发挥其促炎性作用，而在疾病不断的进展中发挥其神经保护作用。其次，目前尚无明确研究解释MIP-1α及炎症机制对ALS患者的确切影响，且MIP-1α的具体作用信号通路尚不明确。再次，许多炎症反应也被认为对机体有益。此外，Tateishi 等[17]研究表明MIP-1β在 ALS 患者中发挥神经保护作用。MIP-1β与MIP-1α具有共同的受体CCR5[5]，尽管趋化因子与其受体间的关系相当复杂，但我们猜测MIP-1β与MIP-1α对 ALS 患者发挥作用可能为同样的信号通路及作用机制，故MIP-1α对 ALS 也可能发挥神经保护作用。

研究中的Cox多因素分析显示，血清MIP-1α水平是ALS患者生存预后的影响因素。血清MIP-1α比CSF MIP-1α更有预后意义，结合研究结果，血清中MIP-1α水平较CSF高，故当机体炎症反应启动时，血清中炎症因子较CSF更快速更明显升高，可能为更敏感的临床标志物之一；此外，研究中采集血清及CSF的时机为ALS患者确诊时，也就是疾病发展的早期，可能此时炎症反应在CNS并未完全激活，故外周血的炎症因子更有意义。但是，血清中比CSF包含更多的细胞因子及趋化因子，更容易受到全身系统性疾病的影响，因此未来将纳入更多的病例，包括不同进展时期的标本去验证本研究结果。

面对如此复杂的疾病，做到准确的早期诊断非常困难，也无特异性的诊断试验，更无有效的治疗措施去改善患者神经功能缺损的状况，故一种可靠的生物标志物不仅仅帮助我们早期诊断疾病，更有可能揭示发病机制，甚至提供治疗新策略。本研究证明，MIP-1α对于ALS疾病进展及预后的潜在意义，提示MIP-1α可能对ALS发挥神经保护作用。但本研究仍存在一些局限性：第一，本研究纳入的病例数较少，且并不是所有入组的ALS患者均留取了CSF标本；第二，本研究纳入的是中国散发性ALS患者，也就是亚裔人群，故并不能代表整个ALS人群，其研究结果也并不一定适用于其他种族ALS以及家族性ALS； 此外，入组ALS患者的ALSFRS-r评分大多数高于30分，意味着入组ALS患者症状相对较轻，神经功能缺损程度相对不重。在未来进一步研究中，将纳入一部分症状严重的患者，纳入更广泛种类的ALS 病例。

本研究结果表明，ALS患者CSF及血清中MIP-1α水平均明显升高，且与疾病病程、进展及生存预后相关，MIP-1α可能为ALS一种具有神经保护作用的生物标志物。未来研究应关注ALS相关机制，探索MIP-1α介导神经炎症反应的机制及信号通路。为了更有力地证实MIP-1α的神经保护作用，促进未来更广范围的临床应用，本研究小组将开展更大规模的病例对照研究以及一系列前瞻性研究，以助于发现 ALS 可靠的生物标志物，早日将基础实验成果应用于临床实践。