青光眼术后干眼患者泪液中MAPK、Sirt1水平与泪膜功能的相关性分析

郭宣妮 姜春辉 朱安泰 王燕 李春艳 王娟妮

青光眼是导致人类失明的三大眼病之一，临床主要采用小梁切除术进行治疗[1]。近年来研究发现，青光眼小梁切除术可影响泪膜的正常功能，甚至导致干眼的发生[2]。干眼是由多种原因引起的泪液异常、泪膜稳定性下降，临床主要表现为眼部干涩、异物感、畏光等[3]。目前，干眼尚无有效的治疗方法，主要通过消除诱因、改善患者营养状况或采用人工泪液等方式治疗[4]。分析影响青光眼小梁切除术后泪膜功能变化的分子标识物，对术后干眼患者的预防和治疗具有重要意义。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是一组参与调控细胞内多种生物学过程的蛋白，参与了干眼的发生发展[5]。沉默信息调节因子相关酶1(silent information regulator of transcription1，Sirt1)是近年来发现的与眼科疾病相关的一种蛋白，在多种眼科疾病，如白内障、视神经病变等中均起到重要作用，但与干眼的关系目前尚未完全清楚[6]。因此，本研究分析了青光眼术后干眼患者泪液中MAPK、Sirt1水平与泪膜功能之间的关系，旨在为青光眼术后干眼患者的治疗提供一定的理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2015年9月至2017年12月在我院确诊的青光眼小梁切除术后干眼患者50例(50眼)为干眼组，男31例、女19例，年龄20～74(51.83±10.27)岁。纳入标准：符合干眼诊断标准[7]，泪膜破裂时间(break-up time，BUT)<10 s，临床表现为眼部干涩、异物感等；在本院接受过小梁切除术治疗的青光眼患者，术后时间为4～18(8.24±3.25)个月。排除标准：患者合并急性严重感染、明显肝肾功能不全；合并血液系统或免疫系统疾病者；合并其他眼部疾病或眼部手术史者；近期使用过可导致干眼的药物。选择同期行青光眼小梁切除术后经复查检测未并发眼部疾病的50例(50眼)患者为对照组，男30例、女20例，年龄20～75(52.21±10.43)岁。两组患者的年龄、性别构成等一般资料相比差异均无统计学意义(均为P>0.05)。本研究通过本院医学伦理委员会审核，入选者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 主要仪器与试剂7500 RT-PCR系统购自美国Applied Biosystems公司；p38MAPK、p-p38MAPK JNK、p-JNK、ERK1/2、p-ERK1/2和Sirt1单克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司；RNA提取试剂盒以及RT-PCR试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；RT- PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。玻璃酸钠滴眼液购自日本参天制药株式会社能登工厂，国药准字J20130150；普拉洛芬滴眼液购自山东海山药业有限公司，国药准字H20093827。

1.3 治疗方法两组患者均行青光眼小梁切除术治疗，常规局部浸润麻醉，做以穹隆及角膜缘为基底的结膜瓣，分离巩膜瓣层，巩膜瓣下置丝裂霉素C棉片3 min，生理盐水冲洗，切除小梁组织，行虹膜周边切除，两端缝扎巩膜瓣，缝合结膜瓣。

1.4 观察项目干眼组患眼均于干眼确诊后治疗前进行相关检测。Western blot检测两组患眼泪液中p38MAPK、p-p38MAPK、JNK、p-JNK、ERK1/2、p-ERK1/2和Sirt1的蛋白表达水平，采用毛细管法无菌采取两组患者的泪液，使用细胞裂解液严格按照蛋白裂解步骤提取总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量，依次SDS-PAGE凝胶电泳，电转膜至PVDF膜，置于50 g·L-1脱脂奶粉溶液中室温密封2 h，TBST洗膜并加一抗于4 ℃孵育过夜，再用TBST洗膜3次后加二抗于室温孵育2 h，电化学发光显影，采用凝胶图像分析系统分析条带强弱，选用β-actin作为内参。采用RT-PCR检测两组泪液中p38MAPK、JNK、ERK1/2和Sirt1 mRNA的表达水平，Trizol法提取细胞总RNA，经反转录试剂盒合成cDNA，进行RT-PCR反应，反应引物、体系和条件参考已有文献[8-9]进行，以GAPDH作为内参。

两组患眼均行泪膜功能检测。(1)BUT检测：采用荧光素钠眼科检测试纸作用于结膜囊10 s，3次眨眼后，记录泪膜表面出现第一个干燥斑的时间；(2)泪液分泌试验(Schirmer I test，SIt)：将泪液检测试纸条一端反折后，置于患者结膜囊中外1/3交界处，闭眼5 min后测量泪液浸湿长度；(3)角膜荧光素染色(fluorescence staining，FL)检测：将荧光素钠眼科检测试纸作用于结膜囊，闭眼30 s后取出，裂隙灯显微镜下观察，将角膜分为4个象限，每个象限0～3分，采用0～12分制记录染色结果，其中，0分为未染色，1分为1～30个点状着色，2分为超过30个点状着色但染色未融合，3分为点状着色融合、丝状物及溃疡等。

2 结果

2.1 两组患者泪液中各因子蛋白和mRMA的表达Western blot检测结果示，与对照组相比，干眼组泪液中p-p38MAPK、p-JNK和p-ERK1/2蛋白的表达水平均显著增加，Sirt1蛋白的表达水平显著下降，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；两组p38MAPK、JNK和ERK1/2蛋白的表达水平相比差异均无统计学意义(均为P>0.05)。RT-PCR检测结果示，干眼组Sirt1 mRNA表达水平较对照组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)；两组p38MAPK、JNK、ERK1/2 mRNA的表达水平相比差异均无统计学意义(均为P>0.05)。见图1。

2.2 两组患者的泪膜功能与对照组相比，干眼组患者的BUT和SIt均显著下降，FL评分显著升高，差异均有统计学意义(均为P<0.001)。见表1。

表1 两组患者青光眼术后泪膜功能

2.3 干眼组患者泪液中各蛋白表达水平与泪膜功能之间的相关性干眼组患者泪液中p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK1/2蛋白表达水平与BUT和SIt均呈显著负相关(rp-p38MAPK=-0.568、-0.583；rp-JNK=-0.342、-0.364；rp-ERK1/2=-0.318、-0.341；均为P<0.001)，与FL评分均呈显著正相关(r=0.614、0.398、0.374；均为P<0.001)。p38MARK、JNK和ERK1/2蛋白表达水平与BUT、SIt、FL评分均无相关性(均为P>0.05)。

2.4 干眼组患者泪液Sirt1蛋白表达水平与泪膜功能之间的相关性干眼组患者泪液中Sirt1蛋白表达水平与BUT和SIt均呈显著正相关(r=0.421、0.443，均为P<0.001)，与FL评分呈显著负相关(r=-0.482，P<0.001)。

3 讨论

有研究显示[10]，青光眼小梁切除术中抗代谢药物的使用、手术切口、术后滤过泡等均会干扰结膜细胞的正常代谢，引起眼表结构和功能的异常，诱导干眼的发生。但青光眼小梁切除术并发干眼的机制尚不清楚，因此，本研究检测了青光眼术后并发干眼患者的泪膜功能和相关蛋白的表达，旨在探讨青光眼术后并发干眼的机制，为临床治疗提供一定的理论基础。本研究中，与青光眼小梁切除术后未并发干眼的患者相比，青光眼术后并发干眼患者的BUT显著缩短，SIt显著下降，FL评分显著增加。BUT、SIt和FL评分均为临床常用的反映干眼患者泪膜功能变化的指标[11-13]，提示青光眼小梁切除术可引起泪膜功能的变化，诱导干眼发生。

MAPK是一组参与细胞内信号转导的重要蛋白，主要包括ERK、p38和JNK三个亚型[14]。研究表明，ERK、p38和JNK信号通路可能参与调控了眼部炎性因子的释放，诱导干眼的发生[15]。本研究中，青光眼小梁切除术后干眼患者泪液中p-p38MAPK、p-JNK和p-ERK1/2的蛋白表达水平均显著增加。马晓昀等[16]研究显示，p38MAPK通路的激活与干燥综合征小鼠的干眼症状密切相关，p38MAPK抑制剂可以有效促进泪液分泌，延长BUT，降低FL评分，改善干眼症状，但其具体的调控机制目前尚不清楚，有待于进一步研究。Sirt1是一种细胞代谢辅酶NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶，与细胞分化、衰老、凋亡和能量代谢等密切相关[17]。有研究表明，Sirt1在多种眼科疾病的发生发展中具有重要作用[18]。本研究结果显示，青光眼小梁切除术后干眼患者泪液中Sirt1蛋白和mRNA的表达水平均显著下降，说明Sirt1参与了干眼的发生发展过程，其具体调控机制有待进一步研究。

本研究结果显示，青光眼小梁切除术后干眼患者泪液中p-p38MAPK、p-JNK和p-ERK1/2蛋白表达水平与FL评分均呈显著正相关，与BUT和SIt均呈显著负相关，其中与p-p38MAPK的相关性最高；Sirt1蛋白表达水平与FL评分呈显著负相关，与BUT和SIt均呈显著正相关，说明p-p38MAPK信号通路和Sirt1蛋白表达水平与泪膜功能显著相关，共同参与了青光眼小梁切除术后干眼的发生发展。

综上所述，青光眼小梁切除术后干眼患者泪液中MAPK的磷酸化水平显著增加，Sirt1蛋白和mRNA的表达水平均显著下降，且二者表达异常与泪膜功能的变化具有显著相关性，说明MAPK、Sirt1有望应用于临床评估青光眼小梁切除术后患者泪膜功能的变化，但其具体的作用机制尚不清楚，有待于今后深入研究。