南珠水解液对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞氧化损伤的保护作用△

刘鹏 岑妍慧 林江 兰太进

白内障，尤其是老年性白内障(age-related cataract，ARC)，是全球最常见的眼病之一，已成为第三世界国家中第一位致盲眼病[1]。白内障是一种因眼球晶状体病变而导致晶状体混浊的疾病，被认为是一种构象疾病。晶状体是人体内蛋白质含量最高的组织，当其α-晶状体蛋白发生氧化损伤时，会导致晶状体蛋白折叠错误增加，加剧蛋白变性，聚集成散射光的聚集体，晶状体就会混浊，这可能是白内障发生的重要原因[2-3]。总的来说，白内障是一种多因素诱发疾病，与衰老、紫外线辐射、氧化应激、内质网应激、糖尿病、吸烟、酒精等有关[4]。尽管每种白内障的确切病因仍然不清楚，但对许多动物模型和人类的研究表明，白内障的形成与晶状体上皮细胞的应激损伤和凋亡有关[5]。抑制晶状体上皮细胞的应激损伤和凋亡能有效防治白内障[6-7]。合浦珍珠产于广西北海合浦，为中国国家地理标志产品。除了作为名贵、高雅的装饰品，合浦珍珠还是著名的道地药材，在我国已有2000多年的药用历史[8]。现代典籍《中华人民共和国药典》及《中药大辞典》均记载：“珍珠具有安神定惊、明目去翳、解毒生肌”的功能。合浦珍珠主要活性物质包含微量元素、类胡萝卜素、维生素B、蛋白质、小分子多肽、多糖、人体所需的8种必需氨基酸，以及具有特殊活性作用的非蛋白氨基酸，如牛磺酸等，其具有很好的抗氧化活性，自古以来就常出现在各种方剂中[9-10]。本课题组前期已采用果蔬、蜂蜜的有机酸、活性酶低温水解合浦珍珠，制得合浦珍珠水解液，能完整保留珍珠原质中的肽等天然活性物质，可用作药品、营养保健品等的原料[11-13]。在本实验中，通过体外制备过氧化氢(H2O2)诱导人晶状体上皮细胞(HLEC)氧化损伤模型，探讨南珠水解液对氧化损伤的HLEC是否具有保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器HLEC细胞株HLEB3(北京北纳联创生物技术研究院)，南珠水解液冻干粉(广西北海市宝珠林海洋科技有限公司)；H2O2(美国Sigma公司)；完全DMEM培养基、CCK8细胞增殖检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)；Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit(MULTI SCIENCES联科生物公司)；SOD试剂盒、GSH-Px试剂盒、MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所)；BCA试剂盒(碧云天生物技术研究所)。酶标分析仪(美国Biotek公司)；透射电镜(日本JEOL公司)；NovoCyteTM流式细胞仪[艾森生物(杭州)有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 HLEC的细胞增殖检测HLEB3细胞培养至70%时消化计数，转移至96孔板中培养，每孔加入100×103个细胞，加入不同浓度(0 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1)南珠水解液，培养到预定时间后，每孔加10 μL CCK8检测试剂，在37 ℃孵育，酶标仪在450 nm波长处检测培养24 h和48 h每孔的吸光度(A)值，计算细胞存活率，并据此选择后续实验中南珠水解液浓度。后续实验分组：正常对照组，不额外加药；氧化损伤组，加入H2O2至终浓度为300 μmol·L-1；南珠水解液处理组，加入H2O2至终浓度为300 μmol·L-1，加入南珠水解液至终浓度200 mg·L-1，培养48 h。

1.2.2 流式细胞术检测细胞凋亡情况收集1×106～3×106个HLEB3细胞，加1 mL PBS 1500 r·min-1离心3 min，洗涤2遍。取300 μL 预冷的1×Binding Buffer 重悬细胞。每管各加入3 μL Annexin V-FITC和 5 μL PI-PE。轻轻吹打混匀后，室温避光孵育10 min。再向每管中加入200 μL 预冷的1×Binding Buffer。混匀后上流式细胞仪检测3组细胞凋亡情况。

1.2.3 电镜下观察3组细胞收集3组细胞。体积分数2.5%戊二醛溶液固定各组细胞24 h，控制温度为4 ℃，10 g·L-1锇酸后固定，0.1 mol·L-1磷酸漂洗液漂洗。乙醇-丙酮梯度脱水，丙酮-环氧树脂梯度包埋，超薄切片机切片70 nm，30 g·L-1醋酸铀-枸橼酸铅双染色，电镜下观察并拍照。

1.2.4 3组细胞生化检测收集3组细胞，破碎细胞提取总蛋白，BCA法测总蛋白浓度，根据试剂盒说明书进行样品处理，然后使用酶标仪在对应波长处检测每孔的A值，检测各组HLEB3细胞内谷光甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量。

2 结果

2.1 南珠水解液对HLEB3细胞生长的作用在HLEB3细胞培养液中加入南珠水解液，分为4组，浓度分别为0 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1和200 mg·L-1。在培养24 h和48 h后检测细胞增殖水平，结果显示：培养24 h后各组细胞增殖水平无明显差异；48 h后50 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1南珠水解液组与空白对照组相比差异均有统计学意义(均为P<0.05)。南珠水解液对HLEB3增殖作用具有一定的剂量依赖效应，在后续实验中选择200 mg·L-1南珠水解液为最佳处理浓度。见表1。

表1 不同浓度南珠水解液处理后HLEB3细胞增殖水平

2.2 南珠水解液对氧化应激导致的HLEB3细胞凋亡作用通过流式细胞仪检测正常对照组、氧化损伤组和南珠水解液处理组细胞凋亡率，结果显示氧化损伤组细胞凋亡率最高，其次是南珠水解液处理组和正常对照组。见表2和图1。

图1 各组细胞凋亡情况 A：正常对照组；B：氧化损伤组；C：南珠水解液处理组

表2 流式细胞仪检测各组细胞凋亡总体情况及早、晚期凋亡情况

2.3 电镜观察各组HLEB3细胞电镜下正常对照组HLEB3细胞表面绒毛状结构较多，细胞质中粗面内质网结构较致密，核糖体密布；氧化损伤组HLEB3细胞表面绒毛状结构较少而且有不少断裂了，有些细胞胞核皱缩，细胞质中粗面内质网结构较疏松，核糖体分散，可见凋亡小体和空泡；南珠水解液处理组HLEB3细胞相对于氧化损伤组细胞质中凋亡小体和空泡较少，粗面内质网结构也更正常。见图2。

图2 各组细胞电镜观察结果 A：正常对照组；B：氧化损伤组；C：南珠水解液处理组

2.4 南珠水解液对HLEB3细胞抵抗氧化损伤的作用各组细胞中GSH-Px和SOD的酶活性以及MDA含量检测结果显示，氧化损伤组细胞中GSH-Px和SOD的酶活性低于正常对照组，南珠水解液处理组细胞中GSH-Px和SOD的酶活性高于氧化损伤组，且GSH-Px的酶活性高于正常对照组；MDA含量则是氧化损伤组最高，其次是南珠水解液处理组和正常对照组。见表3。

表3 各组HLEB3细胞中GSH-PX和SOD酶活性及MDA含量比较

3 讨论

随着我国人口老龄化的日趋严重，ARC发病率逐年上升，已成为我国第一位致盲眼病，严重影响老年人的健康[14]。在发达国家，大多数白内障可以通过手术治疗，而在资源匮乏的发展中国家，许多受白内障影响的患者无法享受到最先进的治疗[15]。所以开发成本较低的方法来预防或延迟ARC的形成，并探讨它们的防治机制具有重要意义。

在生理状态下，HLEC是眼球晶状体新陈代谢最活跃部分，其不断分化为晶状体纤维细胞，承担着晶状体生长、分化及损伤修复作用，对晶状体的内环境稳态、水平衡及透明性等方面起到重要作用[5-16]。一旦晶状体上皮细胞出现病理突变，将会引起晶状体混浊，导致白内障发生[17]。HLEC凋亡是除先天性白内障外各种白内障发生的共同细胞学基础[5]。目前公认的白内障发病机制有氧化损伤学说和细胞凋亡学说。活性氧(reactive oxygen，ROS)如H2O2引起的氧化应激，是HLEC凋亡的重要调节因子，被认为是白内障发生的主要原因[18-19]。因此，预防H2O2诱导的HLEC氧化应激和凋亡可能是延缓白内障发展的重要治疗策略。

珍珠富含多种活性物质，包含微量元素、类胡萝卜素、维生素B、蛋白质、小分子多肽、多糖、多种氨基酸，常作为主要成分用于防治白内障[20-21]，本课题组前期已制备好南珠水解液，且本课题组岑妍慧等[22]发现南珠水解液能促进人微血管内皮细胞增殖和迁移，促进其分泌NO和抑制活性氧分泌，在保护人微血管内皮细胞方面发挥了有效作用。

本研究通过H2O2诱导构建HLEC氧化损伤模型，通过不同浓度的南珠水解液以及不同处理时间观察对HLEB3细胞生长影响，24 h后各组之间无显著差异，说明处理液对细胞无毒害作用；48 h后50 mg·L-1南珠水解液组细胞增殖水平高于空白对照组，而100 mg·L-1南珠水解液组细胞增殖水平高于50 mg·L-1组，100 mg·L-1南珠水解液组细胞增殖水平和200 mg·L-1南珠水解液组差异不显著，说明在48 h时，200 mg·L-1南珠水解液组能够促进HLEB3生长。而为了更好地说明南珠水解液的作用，我们后续实验选择最佳浓度200 mg·L-1南珠水解液处理细胞。

本研究通过流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，发现氧化损伤组细胞凋亡率最高，南珠水解液处理组细胞凋亡率高于正常对照组、低于氧化损伤组。通过定量分析可见南珠水解液可以抑制由H2O2诱导的HLEB3细胞的早期凋亡和晚期凋亡，且对晚期凋亡抑制作用更显著，为南珠水解液防治白内障提供了初步实验依据。

透射电镜可以直接观察到细胞超微形态变化，本研究观察到正常对照组HLEB3细胞表面绒毛状结构较多，细胞质中粗面内质网结构较致密，核糖体密布；氧化损伤组 HLEB3细胞表面绒毛状结构较少，而且有不少断裂了，有些细胞出现细胞核皱缩，细胞质中粗面内质网结构较疏松，核糖体分散，可见凋亡小体和空泡；南珠水解液处理组HLE-B3细胞相对于氧化损伤组，细胞质中凋亡小体和空泡较少，粗面内质网结构也更正常。表明南珠水解液对HLEB3细胞超微结构具有保护作用。

众所周知，氧化应激的发生是由于抗氧化防御系统与细胞内氧化作用失衡所致[23]。眼晶状体内有一系列抗氧化系统，保护其避免氧化损伤。该抗氧化系统由非酶性抗氧化物和酶性抗氧化物组成。非酶性的抗氧化物如谷胱甘肽、类胡萝卜素、维生素C、维生素E、牛磺酸和某些微量元素等，酶性抗氧化物如SOD、GSH-Px等[24]。其中SOD是体内最重要的抗氧化酶之一，能有效清除脂质过氧化过程产生的超氧阴离子自由基，降低其毒性作用，避免对细胞膜和细胞器的损伤，从而保持细胞结构和功能的正常[25]。GSH-Px是体内一种重要的含硒抗氧化酶，能特异性催化谷胱甘肽(glutathione，GSH)对H2O2的还原反应，能有效清除H2O2，从而发挥保护细胞膜结构和功能完整的作用[26]。另外，细胞会产生一些氧化产物，如MDA，为自由基攻击生物膜中多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化作用的最终分解产物，MDA的含量水平可反映机体内细胞脂质过氧化程度，常作为判断脂质过氧化的指标[27]。然而，当HLEC氧自由基产生过多和(或)抗氧化能力降低，会诱发晶状体蛋白氧化损伤变性，引起晶状体混浊，最终诱发白内障[28]。在本研究中，各组细胞中GSH-Px和SOD的酶活以及MDA含量生化检测结果显示，氧化损伤组细胞中GSH-Px和SOD的酶活性显著低于正常对照组，南珠水解液处理组细胞中GSH-Px和SOD的酶活性显著高于氧化损伤组，且GSH-Px的酶活性显著高于正常对照组；MDA含量则是氧化损伤组显著高于南珠水解液处理组和正常对照组。表明南珠水解液通过升高SOD、GSH-Px活性，降低细胞MDA含量来保护HLEB3细胞，能有效防止H2O2诱导的细胞氧化损伤。

总之，本研究结果证实南珠水解液具有抗氧化损伤及抗凋亡作用，其作用机制可能与促进抗氧化酶表达、降低活性氧含量有关，但南珠水解液其具体作用机制，通过什么信号通路发挥保护作用，还有待后续进一步探讨，从而为南珠水解液防治ARC提供更多的实验依据和理论支持。