断裂内含肽C片段在大肠埃希菌表达系统中酶解稳定性的改良

陈 浩，曹 津，张 静，朱建伟，陈俊升

（上海交通大学药学院，细胞工程及抗体药物教育部工程研究中心，上海200240）

断裂型内含肽能够自发催化蛋白质剪接反应，相比连续型内含肽，它具有抑制不可控的提前剪接和剪切的天然优势，常被用于蛋白质纯化、蛋白质连接、毒素蛋白的生产等领域［1-3］。

NpuDnaE 是一种来源于念珠藻（Nostoc punctiforme，Npu）的断裂型内含肽，具有高效、快速的蛋白质反式剪接活性［4-5］，Ramirez 等［6］在NpuDnaE 中引入D118G 突变，获得了巯基化合物依赖性的C端剪切突变体，Guan 等［7］在此基础上开发了快速蛋白纯化系统（SIRP），展现出了NpuDnaE 内含肽在蛋白质标签纯化领域的巨大应用潜力。但有文献报道，NpuC 段融合蛋白在表达纯化过程中会发生降解［7-8］，本课题组前期工作中也发现了NpuC融合蛋白的不同程度降解。这一缺陷将影响前体蛋白收率和产物纯度，进而增加了目的蛋白特别是药用重组蛋白的生产成本。因此，提升NpuC 段在表达、纯化过程中的稳定性，就显得尤为重要。

研究人员发现，断裂内含肽NpuDnaE 的N 段（1-102 aa）和C 段（103-137 aa）的识别、结合、折叠依赖于两者之间的静电作用和疏水作用［8-10］：NpuC携带碱性氨基酸，整体片段带有正电，处于无序状态；NpuN 由NpuN1（1-50 aa）和NpuN2（51-102 aa）两个区域组成，其中NpuN1 主要由疏水性氨基酸组成，处于折叠状态，而NpuN2 集中了大部分的酸性氨基酸残基，带有负电，处于无序状态。在NpuN和NpuC的重构过程中，NpuN2先与NpuC通过静电作用结合、部分折叠，随后与NpuN1 通过疏水作用进一步折叠形成活性构象。他们在研究中还发现NpuC 段的无序状态，可能是造成其对蛋白酶不稳定的原因。因此，推测使NpuC 段在翻译后形成部分折叠，将可能减少降解的产生。

本研究从NpuN和NpuC重构机制出发，构建N端融合NpuN2 片段的NpuC 延长变体N2C，技术路线如图1 所示，以麦芽糖结合蛋白（maltose binding protein，MBP）为NpuC 端外显肽，研究此延长的NpuC 变体在原核表达系统中对NpuC 片段的酶解稳定性的提升作用，并探讨延长变体对内含肽C端剪切反应活性的影响。

1 材 料

1.1 试 剂

Figure 1 Illustration of the“NpuN2 extended NpuC”. The reconstitution of Npu DnaE follows the“Capture and Collapse”mechanism.NpuC is highly basic,and is disordered,which makes it sensitive to proteolytic degradation (A); NpuN is comprised of two different lobes,NpuN1 (residues 1-50) is partially folded while NpuN2 (residues 51-102) is acidic and disordered (B). NpuC preferentially binds to NpuN2 through the electrostatic interaction to form a compacted intermediate[8]. When N-terminally fused with NpuN2(C),NpuC would readily to form the compacted NpuN2-NpuC intermediates, which would confer NpuC with improved resistance to proteolytic degradation(D)

PCR 所用DNA 聚合酶、连接酶和限制性内切酶均购自宝生物工程（大连）有限公司；质粒DNA抽提试剂盒、DNA 凝胶回收试剂盒和PCR 清洁试剂盒均购自康宁生命科学（吴江）有限公司；ECL发光显色液购自苏州新赛美生物科技有限公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和二硫苏糖醇（DTT）购自美国Sigma 公司；抗MBP 一抗（鼠源）、抗His 一抗（鼠源）、和羊抗鼠二抗均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；引物合成及DNA 测序服务由生工生物工程（上海）股份有限公司提供；其他试剂均为市售分析纯。

1.2 仪 器

DNA 凝胶电泳仪和凝胶成像分析系统（上海Tanon 科技有限公司）；蛋白凝胶电泳仪（美国Bio-Rad 公司）；LRH-70F 型生化培养箱（上海天呈仪器制造有限公司）；镍柱亲和色谱填料（通用电气（中国）医疗集团生命科学部）；Dextrin Beads 6FF 填料（常州天地人和生物科技有限公司）。

1.3 菌株和质粒

大肠埃希菌DH5α 和大肠埃希菌BL21（DE3）购自苏州新赛美生物科技有限公司；包含MBP 的质粒pET30a/MBP、包含NpuDnaE断裂内含肽的质粒pET28a/Npu、包含硫氧还蛋白（Trx）标签的质粒pET32a/野生型，均为本实验室保藏。

2 方 法

2.1 重组表达质粒的构建

本研究使用MBP 作为NpuC 端外显肽，将NpuC段内含肽与之融合后在原核表达系统中进行诱导表达。表达质粒的名称、抗性、目的基因片段的理论相对分子质量等信息见表1，本实验中用到的引物信息见表2。

Table 1 Resistance,insert gene length and restriction enzymes of the recombinant plasmids constructed in this study

Table 1 Resistance,insert gene length and restriction enzymes of the recombinant plasmids constructed in this study

本研究中构建的质粒均以基本的分子生物学实验手段，以酶切连接的方法进行构建。以下以pET30a/N2C-MBP 重组表达质粒的构建为例进行说明。

以上游引物NpuN2-F，含有限制性酶切位点NdeI，下游引物NpuC-MBP-R，以pET28a/Npu质粒为模板扩增N2C 片段。PCR 条件为：98 ℃变性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸10 s，35 个循环后，72 ℃终延伸5 min。PCR 产物通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收待用。同样的PCR 方法以pET30a/MBP 质粒为模板，NpuC-MBP-F 和MBP-R为引物扩增MBP片段。

通过重叠PCR 连接N2C 片段和MBP 片段，以NpuN2-F 为上游引物，MBP-R 为下游引物，以回收的N2C 片段和MBP 片段DNA 为模版，重叠PCR 扩增N2C-MBP 片段，PCR 程序同N2C 片段的扩增。琼脂糖凝胶电泳分离得到的N2C-MBP 连接片段，用NdeⅠ和KpnⅠ双酶切后，连入经过NdeⅠ和KpnⅠ双切的pET30a 质粒中，将连接产物转化入大肠埃希菌DH5α感受态中，挑取单克隆提取质粒并送测序。

表1 中所列其他重组表达质粒均以酶切连接方式构建，目的基因DNA 片段使用对应引物进行扩增。

除外源生物物种的直接输入对受水湖泊生物群落有影响外，引水调控引起的受水湖泊水环境条件的变化对湖泊生物群落的结构、组成以及演替也可能会有影响。引水调控工程以缓解湖泊蓝藻水华灾害为主要目的之一，对受水湖泊浮游藻类群落特征的影响最为直接，以浮游藻类群落作为引水调控工程湖泊生态效应的指示生物能快速反映引水的湖泊生态效应[110]。

2.2 重组蛋白的诱导表达及纯化

2.2.1 重组蛋白的诱导表达 将以上所得重组表达质粒分别转化入大肠埃希菌BL 21（DE3）中得到相应重组蛋白表达菌株。挑取单克隆菌落分别接种至含有对应抗性的LB 培养基中，在37 ℃，220 r/min 摇床培养9 h 后，将获得的种子菌液按1∶100接种量接种至LB 培养基500 mL 中继续培养，当A600达到0.6 时，加入IPTG 至终浓度1 mmol/L，过夜诱导培养（25 ℃，180 r/min）。重组蛋白的相对分子质量、等电点等信息如表3所示。

2.2.2 重组蛋白的亲和纯化 过夜诱导表达的培养液经4 ℃，5 000 r/min 离心15 min，收集菌体，用上样缓冲液（20 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑）将沉淀菌体重悬分散，用高压均质机加压至900 bar（1 bar = 0.1 MPa），4 ℃破菌5 min 后，减压收集破裂菌液。然后转移至离心机内，4 ℃，12 000 r/min 离心30 min，收集上清液并用0. 45 μm 滤膜过滤后，上样于镍亲和色谱柱，用上样缓冲液和2 mol/L 咪唑母液配置不同浓度的缓冲液进行梯度洗脱。收集纯化过程中的流穿及各洗脱浓度下收集的样品，进行SDS-PAGE 电泳检测。

对于NpuC 段重组蛋白，先经过上述镍柱亲和纯化步骤纯化，收集200 mmol/L 咪唑洗脱液，用Dextrin Beads 6FF（MBP 标签亲和重力柱）纯化，使用 洗 脱 液（20 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L 麦芽糖，pH 8.5）洗脱。收集纯化过程中的流穿及洗脱样品，进行SDS-PAGE电泳检测。

2.3 N2C的C端剪切反应

2.3.1 Western blot和SDS-PAGE 检测N2C 的C端剪切反应 为研究N2C的C端剪切反应活性，本研究进行的C 端剪切反应如表4 所示，其中反应编号1 为阳性对照组。剪切反应体系如下：N 段和C 段底物物质的量比（以下简称：N/C 比例）为5∶1，DTT浓度为1 mmol/L，反应温度为37 ℃。

反应体系在不同时刻取样，并立即加入还原型5×蛋白上样缓冲液，95 ℃煮样5 min 终止反应。反应结果用SDS-PAGE 和Western blot 进行检测，WB 分别使用抗组氨酸抗体（anti-His）和抗麦芽糖结合蛋白抗体（anti-MBP）作为一抗。

2.3.2 影响N2C的C端剪切反应因素 为了进一步研究N2C 的剪切反应条件耐受性，本研究对影响其反应速率和产物生成率的3个因素进行考察：对反应温度的考察中，N/C 比例为5∶1，DTT 浓度为1 mmol/L，温度分别选取4，25，30，37 ℃进行实验；对N/C 比例的考察中，温度为30 ℃，DTT 浓度为1 mmol/L，N/C 比例分别选取1∶1，3∶1，5∶1，10∶1 进行实验；对DTT 浓度的考察中，温度为30 ℃，N/C比例为5∶1，DTT浓度分别选取0，1，5，10，50 mmol/L进行实验。对以上3个因素考察的C端剪切反应底物为N2C-MBP和NpuN。

Table 4 Reactions to study N2C C-terminal cleavage reaction activity(No.2,No.3,No.4)and reaction of wild type Npu DnaE intein(No.1)

内含肽C 端剪切反应在0，5，10，30，60，120，360，1 440 min 时刻取样，并用SDS-PAGE 电泳检测，用Image J 软件对SDS-PAGE 电泳图上的产物条带和底物条带进行灰度扫描，并按照如下公式计算C 端剪切反应产物生成率。产物生成率（%）=（产物条带灰度值/产物相对分子质量）/［（底物条带灰度值/底物相对分子质量+（产物条带灰度值/产物相对分子质量］×100。反应结果制作曲线。

3 结 果

3.1 重组表达质粒的构建

PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示N2C-MBP 片段（1 407 bp）、Trx-N2C-MBP 片段（1 773 bp）、Trx-NpuC-MBP 片段（1 587 bp）、Trx-MBP 片段（1 461 bp）、NpuN1 片段（222 bp）和NpuN片段（336 bp）均与理论片段大小一致，电泳结果如图2。双酶切连接后转入大肠埃希菌DH5α 中，抽提质粒后送DNA测序，结果表明质粒构建成功。

Figure 2 Detection of the PCR products amplified from the constructed plasmids by agarose gel electrophoresis(A)N2C-MBP;(B)1-2:Trx-N2C-MBP;(C)1-2:Trx-NpuC-MBP,3:Trx-MBP;(D)NpuN1;(E)NpuN

3.2 NpuC 段重组蛋白在表达纯化过程中的降解情况

NpuC 段重组蛋白经两步纯化后，用SDSPAGE 检测延长前后的降解情况，并对条带进行灰度扫描作图，结果如图3、图4 所示，纯化条带大小均符合理论相对分子质量。Trx-NpuC-MBP在表达纯化过程中，发生31.4%～51.6%的降解（图3-A，图4-B），不含NpuC 的重组蛋白Trx-MBP 不发生降解（图3-B），提示降解发生在NpuC 段上；此外，在表达过程中，NpuC 降解条带并不明显（图3-A，泳道2），而在裂菌纯化后（图3-A，泳道5～8），出现降解条带，提示NpuC 的降解发生在菌体裂解之后，与文献报道一致。

3.3 N2C的C端剪切反应

3.3.1 Western blot 检 测N2C 的C 端 剪 切 反 应将不同的N 与C 底物混合反应，WB 考察C 端断裂反应，结果如图5 所示：NpuN1 与N2C-MBP 的反应体系，在42 kD 附近出现单一条带（图5，泳道1～2），符合预期产物相对分子质量大小；阳性对照组NpuN 和Trx-NpuC-MBP 反应体系，在42 kD 附近出现单一条带（图5，泳道3～4），符合预期产物相对分子质量大小；延长变体N2C-MBP 和Trx-N2CMBP 与NpuN 的反应体系，在42 kD 附近出现单一条带（图5，泳道5～8），符合预期产物相对分子质量大小。即，N2C 与NpuN1 和NpuN 均能够发生C端剪切反应。

Figure 3 SDS-PAGE analysis of NpuC-Fusion expression and purificationA:Trx-NpuC-MBP;B:Trx-MBP;C:N2C-MBP;D:Trx-N2C-MBP purification,using Ni column and Dextrin Beads 6FF.BI:before induction,AI:after induction,SF:soluble fraction after lysis,IF:insoluble fraction after lysis,FT1:flow through by Ni column,FT2:flow through by Dextrin,W:20 mmol/L imidazole wash,E1:200 mmol/L imidazole elution,E2:elution by Dextrin.←denotes fusion protein,+denotes degradated species

Figure 4 SDS-PAGE and grayscale scanning analysis of NpuC-Fusion after purificationA:SDS-PAGE of NpuC-fusion,Lane 1,3,5,7,9,11 and 13 were protein eluted by 200 mmol/L imidazole,lane 2,4,6,8,10 and 12 were protein purified by Dextrin. ←denotes fusion protein,+denotes degradated species;B:Degradation histogram of NpuC-fusion(±s,n=4)

3.3.2 SDS-PAGE 检 测N2C 的C 端 剪 切 反 应N2C 的C 端剪切反应用SDS-PAGE 检测结果如图6所示，Image J 对结果灰度扫描计算剪切反应时间曲线结果如图7 所示。在1 mmol/L DTT 催化，N/C比例为5∶1，37 ℃反应条件下：N2C 与NpuN1 的剪切反应（图6-B），24 h 仅有40%产物生成；N2C 与NpuN的剪切反应（图6-C，6-D），10 min产物生成率达到70%，30 min达90%以上；阳性对照组NpuC野生型的C端剪切反应（图6-A），5 min产物生成率达90%以上。即，N2C 和NpuN 反应具有和阳性对照组相似的快速剪切的反应特点，但N2C 和NpuN1反应效率较差，故对影响C端剪切反应因素的考察中使用N2C-MBP和NpuN进行实验。

3.3.3 影响N2C的C端剪切反应的因素 对影响内含肽剪切反应因素的考察结果如图8所示。

对不同反应温度进行考察，结果如图8-A 所示，37 ℃下反应最快，10 min 产物生成率达到70%，1 h 即达到平衡；而达到70%的产物生成率，在30 ℃下需30 min、25 ℃下需60 min、4 ℃下则需6 h以上；反应24 h后，所有考察温度下产物生成率均达到90%以上。

对不同N/C 比例进行考察，结果如图8-B 所示，N/C 比例为1∶1 时反应初始速率较慢；NpuN 段过量条件下，进一步增加NpuN 用量反应效率没有明显差异；24 h 后，所有考察N/C 比例下产物生成率均在90%以上。

对DTT 浓度进行考察，结果如图8-C 所示，在0～50 mmol/L DTT 浓度下，剪切反应10 min 产物生成率均达到50%；2 h后，产率均达到90%以上。

Figure 5 Western blot analysis of the C-terminal cleavage activity of N2C. Reactions were carried out at 37 °C with the N-C ratio of 5∶1, in the presence of 1 mmol/L DTT. The compositions of the reactions were indicated above the figure. Reactions between NpuN fragments and N2C fusions were visualized by Western blot, using anti-His antibody(A) or anti-MBP antibody (B) as the primary antibody respectively.‘MBP’is the cleaved product

4 讨 论

内含肽在蛋白质工程领域是一类颇具应用价值的工具，断裂型内含肽NpuDnaE 在介导蛋白质剪接和C端剪切方面表现出快速和高效的特点，展现出重大的应用潜力，譬如介导免疫毒素的生产［11-12］、双特异性抗体的装配［13］、重组蛋白的标签纯化［14-15］等。但其在应用中遇到的NpuC段发生的降解，使其在生产应用中的收率和产物的纯度方面受到一定程度的影响。此外，在肿瘤微环境下一些基质金属蛋白酶也可能对NpuDnaE内含肽造成酶解，限制了NpuDnaE在体内，特别是肿瘤微环境当中的应用［11］。因此，研究如何提高NpuC 段的稳定性具有关键意义。

Figure 6 SDS-PAGE analysis of the C-terminal cleavage activity of N2C. Reactions were carried out at 37°C with the N-C ratio of 5∶1,in the presence of 1 mmol/L DTT. Aliquots at specified time points were visualized on SDS-gels. A:reaction between NpuN and Trx-NpuC-MBP;B:reaction between NpuN1 and N2C-MBP;C:reaction between NpuN and Trx-N2C-MBP;D:reaction between NpuN and N2C-MBP.‘Trx-NpuC’and‘Trx-NpuN2-IC’are the cleaved C-intein fragments.‘+’denotes unidentified band

Figure 7 Time course of the cleavage product formation of different reactant combinations. C-terminal cleavage reactions were carried out at 37 °C in the presence of 1 mmol/L DTT, with the N-C ratio of 5∶1.Aliquots were removed from the mixture at specified time points and quenched by adding SDS-PAGE loading buffer and then visualized by SDS-PAGE

本研究基于N/C 重构机制构建了N 端融合NpuN2 片段的NpuC 延长变体N2C，探究了其在原核表达系统中融合表达、纯化过程中的稳定性，并探究了N2C 发生剪切反应的可行性。结果显示，N2C 在表达、纯化过程中，降解产物占比从31. 4%～51.6%降低到了2.7%～7.2%；且N2C能与全长NpuN 段发生快速、高效的C 端剪切反应。值得注意的是，N2C 与NpuN1 反应效率较低（24 h，40%），较低的反应效率可能与NpuN 和NpuC 的重构机制有关：NpuN1 通过疏水作用与NpuN2 和NpuC 的复合物进一步折叠，作用力弱于NpuN2 与NpuC 的静电作用，因而表现为N2C 与NpuN1 反应效率降低；另外，全长NpuN 能够与N2C 有较高的反应效率，可能是由于N2C 中的NpuC 虽然通过静电相互作用与融合的NpuN2 相互结合，但由于NpuN2与NpuC的结合、折叠处于动态可逆过程，过量的全长NpuN 会与N2C 中的N2 片段竞争结合NpuC段，形成能反应的正确折叠构象。

本研究还对影响断裂内含肽C 端剪切反应的因素、反应温度、N/C 比例、还原剂DTT 浓度等条件进行了考察，N2C 延长变体表现出与NpuC 野生型相似的条件耐受性［6］。对上述各因素的考察，表明N2C延长变体能够减少NpuC在融合表达纯化过程中的降解，同时具有良好的C 端剪切反应活性，为其应用在蛋白质纯化领域奠定了基础。同时，本课题仍有许多方面可以进行更为深入的研究，例如：对其他影响断裂型内含肽反应效率的因素进行考察优化，如纯化、剪切反应中盐离子浓度、pH等条件；研究N2C 内含肽对其介导的蛋白质剪接反应造成的影响等。

Figure 8 Time course of N2C C-terminal cleavage under different temperatures (A), different ratios between NpuN and N2C (B), and different concentrations of DTT(C)(±s,n=3). Aliquots were taken at different time points and ran on SDS-gels,then the band intensities corresponding to reactants and products were quantified by Image J