PD-L1疫苗中引入不同免疫原性氨基酸对T细胞亚群分化的影响

陈红梅，康彦良，刘 利，姚文兵，田 浤

（中国药科大学生命科学与技术学院，江苏省生物药物成药性研究重点实验室，南京210009）

免疫原性氨基酸是一类能增强多肽、蛋白免疫原性的非天然氨基酸，如硝基苯丙氨酸、硝基酪氨酸等［1-2］，对自身免疫性疾病的发病、肿瘤的免疫逃逸等生理病理过程有重要影响。免疫原性氨基酸改变蛋白质免疫原性的作用在免疫病理学、肿瘤免疫学等领域中受到了广泛关注。

含有免疫原性氨基酸的蛋白质可以在多种病理条件下自发形成，如：酪氨酸的硝基化修饰与自身免疫性疾病密切相关。例如，在类风湿关节炎患者的滑液和系统性红斑狼疮或急性肺损伤的患者血清中已鉴定出抗硝基酪氨酸抗体［3-5］。含有酪氨酸硝基化修饰的蛋白质具有潜在的免疫原性［6］，高水平的酪氨酸硝基化蛋白会激活免疫系统，可能在维持自身性免疫疾病中起重要作用。此外，也有研究人员用化学或生物学的方法将免疫原性氨基酸引入蛋白质或多肽中，以此改变目标分子的免疫原性。例如：Hardy 等［7］曾经将3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine，3NO2Tyr）引入到抗原表位肽的特定位置，通过改变MHC I 限制性抗原接触位置间接影响T细胞的识别。课题组前期研究也发现，将 4- 硝 基 苯 丙 氨 酸（4-nitrophenylalanine，4NO2Phe）定点引入到人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）、细胞程序性死亡配体1（programmed death ligand 1，PD-L1）等自体蛋白中，不仅能诱导机体产生高滴度抗HER2、抗PD-L1的抗体，还能刺激CD4+T细胞激活，辅助CD8+T细胞产生抗体依赖性细胞介导的杀伤作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）和细胞毒性T 淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）介导的杀伤效应，成为有效的肿瘤疫苗候选分子［8-10］。

尽管硝基取代的苯丙氨酸和酪氨酸均是免疫原性氨基酸，但3-硝基酪氨酸在各种病理条件下由一氧化氮合酶催化产生，属于酪氨酸的衍生物，而4-硝基苯丙氨酸并不能在机体内自发形成，属于非天然的外源氨基酸，两者在机体内诱发的免疫应答可能存在差异，尤其是这两种免疫原性氨基酸对T细胞亚群分化的影响，可能对机体免疫耐受和自身免疫之间的平衡存在重要影响。然而，关于免疫原性氨基酸对T 细胞亚群分化影响的研究报道较少。

为了解决这一问题，本文利用遗传密码扩充技术在PD-L1 疫苗的相同位点分别引入了3-硝基酪氨酸和4-硝基苯丙氨酸，比较二者对CD4+T细胞不同亚群的影响以及CD8+T细胞的激活情况，从而分析二者的引入对机体免疫耐受和自身免疫之间的平衡是否存在不同的影响，为后续基于免疫原性氨基酸的蛋白疫苗的设计提供指导。

1 材 料

1.1 试 剂

3-硝基酪氨酸、4-硝基苯丙氨酸（上海吉尔生化有限公司）；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、L-阿拉伯糖（L-Ara）、卡那霉素（Kan）、氯霉素（Cm）（南京鼎国生物技术有限公司）；BCA 蛋白定量分析试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗小鼠IgG、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的山羊抗小鼠IgG、CpG（美国Sigma 公司）；白细胞激活刺激剂（Leukocyte Activation Cocktail，with BD GolgiPlug™）、流式固定/破膜液（Cytofix/Cytoperm Soln Kit）、流式抗体等（美国BD公司）。

1.2 仪 器

Multiscan 自动酶标仪、高速冷冻离心机、恒温培养箱（美国Thermo 公司）；Countstar 全细胞计数仪（上海泽权仪器设备有限公司）；水平离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）；Accuri C6 Plus 流式细胞仪（美国BD公司）。

1.3 动 物

清洁级C57BL/6 雌性小鼠（6～8 周龄）购自扬州大学比较医学中心，合格证号：SCXK（苏）2017-0001。所有动物实验均符合动物伦理委员会标准。

1.4 菌种和质粒

E.coliBL21（AI）为中国药科大学江苏省生物药物成药性研究重点实验室保存。

2 方 法

2.1 WT PD-L1疫苗分子的表达

将实验室前期构建的WT PD-L1 疫苗分子的甘油菌pET28-PD-L1 BL21（DE3）接种于20 mL LB培养基小瓶中（Kan），37 ℃，220 r/min 培养过夜，取活化的菌液接种于至200 mL LB（Kan）培养基大瓶中，37 ℃，220 r/min 培养3 h 后，测得A600为0.6～0.8，加入终浓度为1 mmol/L IPTG 诱导剂，诱导8 h，取诱导前后的菌液进行SDS-PAGE 验证蛋白是否表达，8 000 r/min 离心10 min 收集菌体，保存于-20 ℃。

2.2 3-硝基酪氨酸和4-硝基苯丙氨酸取代的PDL1表达菌株的构建

将编码PD-L1 疫苗分子的11 位氨基酸密码子突变为琥珀密码子TAG，将突变体基因片段和质粒载体pET28a 利用NcoⅠ、Hind Ⅲ进行双酶切，胶回收酶切产物，T4 DNA 连接酶16 ℃过夜连接。连接产物转化至E.coliDH10B 大肠埃希菌感受态细胞，37 ℃培养过夜。次日挑取阳性克隆，接种在含Kan 性的液体LB 培养基中，37 ℃，220 r/min 过夜培养。取菌液测序，测序正确的质粒命名命名为pET28a-3NO2Tyr11PD-L1。将质粒转化至实验室前期构建的含pAC-3NO2TyrRS 质粒的E.coliBL21（AI）感受态细胞中，涂布于Kan/Cm 双抗的LB 平板，37 ℃倒置培养过夜。挑取阳性克隆并进行表达验证，菌命名为3NO2Tyr11PD-L1-BL21（AI）。4-硝基苯丙氨酸取代的PDL1 质粒以及表达菌株按同样方法的构建，质粒命名为pET28a-4NO2Phe11PD-L1，菌命名为4NO2Phe11PD-L1-BL21（AI）。

2.3 3-硝基酪氨酸和4-硝基苯丙氨酸取代的PDL1蛋白的表达与纯化

将保存的3NO2Tyr11PD-L1-BL21（AI）菌种接种于2 mL LB 培养基的试管中（Kan/Cm）振荡培养过夜。将活化的菌液接种于至200 mL LB（Kan/Cm）培养基大瓶中，37 ℃，220 r/min 培养3 h 后，测得A600为0.6～0.8，加 入 终 浓 度 为0.15% L-Ara、1 mmol/L IPTG 诱导剂及终浓度0.1 mol/L 的3NO2Tyr，诱导8 h，8 000 r/min 离心10 min 收集菌体，称重，按1∶10（g/mL）的比例加入包涵体洗涤液，4 ℃搅拌30 min。超声破碎，离心收集沉淀，加入包涵体洗涤液清洗，去除杂蛋白以及核酸。随后按1∶10（g/mL）的比例加入含有8 mol/L 脲素的变性液，4 ℃搅拌变性过夜。变性液经镍亲和色谱柱纯化后将目的蛋白按1∶4 比例进行复性。将复性液于20 mmol/L Tris-HCL 冲液透析除盐，超滤浓缩。所获得的的目的蛋白进行SDS-PAGE 检测和Western blot 鉴定。不含免疫原性氨基酸的野生型PD-L1（WT PD-L1）和4NO2Phe11PD-L1 按同样方法制备。

2.4 动物分组及免疫方案

将6～8 周雌 性C57BL/6 小鼠随机分为PBS、WT PD-L1、3NO2Tyr11PD-L1、4NO2Phe11PD-L1 共4组，每组8 只。与CpG 佐剂联合使用皮下免疫小鼠，每周免疫1 次，每次每只给药剂量为50 μg，佐剂10 μg，一共免疫3次，第28天处死小鼠。

2.5 流式细胞术测定各组对T 细胞亚群分化的影响

处死小鼠后，浸泡于75%乙醇中5 min，无菌条件下取出小鼠脾脏，研磨过70 μm 筛网，加入PBS 1 mL 于培养皿中洗残留细胞并过筛，1 200 r/min 离心5 min 收集细胞。用PBS 重悬洗涤细胞1次，加入裂解液轻柔吹悬准确控制时间裂解10～15 min，1 200 r/min离心5 min。收集细胞用PBS轻柔洗涤1 次，弃上清液，加入适量无菌RPMI 1640培养基（含10%FBS）对细胞进行重悬，计数，稀释为每毫升1×106个细胞备用。

细胞标记：Th1（CD4-FITC、IFN-γ-Cy5.5），Th2（CD4-FITC、IL-4-APC），Treg（CD4-FITC、CD3-Cy5.5、Foxp3-PE、CD25-APC），Th17（CD4-FITC、CD3-Cy5.5、IL17-APC），CD8（CD8-FITC、IFN-γ-Cy5.5）。

设置单染组：空染组（加转录因子缓冲液）、CD4 组（先加CD4 抗体，后加Cytofix/Cytoperm Soln Kit）、IL-4 组（先加Cytofix/Cytoperm Soln Kit，后加IL-4 抗体）、IFN-γ 组（先加Cytofix/Cytoperm Soln Kit，后加IFN-γ抗体）、CD8组（先加CD8抗体，后加Cytofix/Cytoperm Soln Kit）、CD25（先加CD25 抗体，后加转录因子缓冲液）、FOXP3（先加转录因子缓冲液，后加FOXP3 抗体）、IL17（先加Cytofix/Cytoperm Soln Kit，后加IL-17抗体）。

CD8/Th1/Th2/Th17 细胞染色：取每个小鼠脾脏细胞1×106个铺板于24 孔板，每孔1 mL，每孔加入Leukocyte Activation Cocktail，with BD GolgiPlug™2 μL 刺激，孵育5 h。 离心收集细胞收集细胞于2 mL EP 管中（以下所有溶液提前4 ℃预冷），离心（4 ℃，1 000 r/min，5 min），加入PBS 1 mL，离心（4 ℃，1 000 r/min，5 min），加入CD4/CD8 抗体，冰上避光孵育30 min，然后加入PBS 1 mL，离心（4 ℃，1 300 r/min，5 min），每孔加入细胞破膜液250 μL，冰上避光孵育15 min，然后加入工作洗涤液1 mL，离心（4 ℃，1 300 r/min，5 min），弃上清液，再加入工作洗涤液1 mL，离心（4 ℃，1 300 r/min，5 min）。分别加入对应的流式抗体，冰上避光孵育30 min。再加入工作洗涤液1 mL，离心（4 ℃，1 300 r/min，5 min）。加入PBS 300 μL 重悬。流式细胞仪检测。

Treg 细胞染色：取每个小鼠脾脏细胞1×106个铺板于24 孔板，每孔1 mL，每孔加入Leukocyte Activation Cocktail，with BD GolgiPlug™2 μL 刺激，孵育5 h。离心收集细胞收集细胞于2 mL EP 管中（以下所有溶液提前4 ℃预冷），离心（4 ℃，1 000 r/min，5 min），加入PBS 1 mL，离心（4 ℃，1 000 r/min，5 min），加入CD4 和CD25 抗体，冰上避光孵育25 min，然后加入PBS 1 mL，离心（4 ℃，1 300 r/min，5 min），每孔加入转录因子缓冲液1 mL，冰上避光孵育40 min。然后加入工作洗涤液2 mL，离心（4 ℃，1 300 r/min，5 min），弃上清液，重复1 次。加入FOXP3 抗体，冰上避光孵育50 min。再加入工作洗涤液2 mL，离心（4 ℃，1 300 r/min，5 min）。加入PBS 300 μL重悬。流式细胞仪检测。

2.6 统计学分析

采用GraphPad Prism 7 软件进行统计学分析。采用One-Way ANOVA 进行数据显著性比较，P ＜0.05为显著性差异，具有统计学意义。

3 结 果

3.1 3NO2Tyr11PD-L1和4NO2Phe11PD-L1菌株的构建

3NO2Tyr11PD-L1 和4NO2Phe11PD-L1 的质粒构建图谱如图1 所示，在PD-L1 相同位点分别引入3NO2Tyr 和4NO2Phe，用 于PD-L1 突 变 体 蛋 白 的表达。

Figure 1 Plasmid map of 3NO2Tyr11PD-L1（A）and 4NO2Phe11PD-L1（B）

3.2 WT PD-L1、3NO2Tyr11PD-L1 和4NO2Phe11PDL1蛋白的表达

对WT PD-L1、3NO2Tyr11PD-L1 和4NO2Phe11PD-L1 蛋白进行表达，取诱导前后全菌进行SDSPAGE。结果如下图2 所示，诱导后菌体在相对分子质量27 kD 左右的位置出现条带，与目的蛋白的相对分子质量大小相符。

3.3 WT PD-L1、3NO2Tyr11PD-L1、4NO2Phe11PD-L1蛋白的纯化及Western blot鉴定

用镍亲和色谱柱对WT PD-L1、3NO2Tyr11PDL1、4NO2Phe11PD-L1 进行纯化，目的蛋白经过复性、透析、超滤浓缩之后，进行SDS-PAGE 以及Western blot 鉴定。如图3 所示获得纯度大于90%的WT PD-L1及突变体蛋白，且经Western blot验证表明WT PD-L1及突变体正确表达。

3.4 4NO2Phe11PD-L1 和3NO2Tyr11PD-L1 免疫对小鼠脾脏内Th1、Th2细胞亚群的影响

流式细胞术分析4NO2Phe11PD-L1 以及3NO2Tyr11PD-L1 免疫后小鼠脾脏内Th1、Th2 细胞比例变化，结果如图4 所示，4NO2Phe11PD-L1 免疫组小鼠脾脏内Th1 细胞比例（2.52 ± 0.04）%显著高 于PBS 组（1.99 ± 0.08）%，而Th2 细 胞 比 例（0.26 ± 0.04）%显 著 低 于PBS 组（P＜0.05）。3NO2Tyr11PD-L1 免疫组小鼠脾脏内Th2 细胞比例为（0.20 ± 0.02）%，显著低于PBS 组，但3NO2Tyr11PD-L1 免疫对Th1 细胞的比例无明显影响（P＞0.05）。实验结果提示，4-硝基苯丙氨酸在PD-L1疫苗中的引入能使Th1/Th2细胞平衡趋向Th1细胞。

Figure 2 SDS-PAGE analysis of the expression WT PD-L1 and mutated PD-L1A:WT PD-L1;B:3NO2Tyr11PD-L1;C:4NO2Phe11PD-L1. M:Marker,1:Before IPTG induction,2:After IPTG induction

Figure 3 SDS-PAGE analysis and Western blot identification of WT PD-L1 and mutated PD-L1(A)WT PD-L1. M:Marker,1:Purified WT PD-L1;(B)3NO2Tyr11PD-L1. M:Marker,1:Purified 3NO2Tyr11PD-L1;(C)4NO2Phe11PD-L1. M:Marker,1:Purified 4NO2Phe11PD-L1

3.5 4NO2Phe11PD-L1 和3NO2Tyr11PD-L1 免疫小鼠对脾脏内Treg细胞比例的影响

流式细胞术分析4NO2Phe11PD-L1 以及3NO2Tyr11PD-L1 免疫后小鼠脾脏内Treg 细胞比例变化，结果如图5 所示，与PBS 组（3.78 ± 0.06）%相比，4NO2Phe11PD-L1 组小鼠脾脏内Treg 细胞比例（2.90 ± 0.20）% 显 著 降 低（P＜0.01），而3NO2Tyr11PD-L1 组Treg 细胞比例（5.34 ± 0.44）%与PBS组相比则明显提高（P＜0.05）。

3.6 4NO2Phe11PD-L1以及3NO2Tyr11PD-L1免疫小鼠后脾脏内Th17细胞比例

通过流式细胞术测定脾脏内Th17 细胞的比例，结果发现，如图6 所示，与其他各组相比，3NO2Tyr11PD-L1 免疫小鼠后，脾脏内Th17 细胞的比例显著增高，4NO2Phe11PD-L1免疫后对小鼠脾脏内Th17 细胞比例没有明显影响。随后分析了Th17/Treg 细胞的比例，发现3NO2Tyr11PD-L1 组与4NO2Phe11PD-L1 组 无 显 著 性 差 异［（0.33 ±0.06）%vs（0.28 ± 0.03）%］，上述结果提示，3-硝基酪氨酸可能在体内作为一种炎症信号发挥作用，对Th17细胞亚群影响较大，而4-硝基苯丙氨酸对Treg 细胞亚群作用更明显，提示机体可能把含4-硝基苯丙氨酸的蛋白质作为外源蛋白处理。

3.7 4NO2Phe11PD-L1 和3NO2Tyr11PD-L1 免疫小鼠对脾脏内CD8+T细胞的影响

Figure 4 Immunization of 4NO2Phe11PD-L1 and 3NO2Tyr11PD-L1 induces polarization of naïve CD4+T cells to Th1 cells(±s,n=8)A:Frequency of Th1 cells;B:Frequency of Th2 cells;C:Rations of Th1/Th2 cells*P＜0.05, **P ＜0.01;ns:not significant

Figure 5 Effect of 4NO2Phe11PD-L1 and 3NO2Tyr11PD-L1 immunization on the frequency of Treg cells(±s,n=8)*P＜0.05, **P ＜0.01

通过流式细胞术分析4NO2Phe11PD-L1 和3NO2Tyr11PD-L1 免疫后小鼠脾脏内CD8+T 细胞的激活情况，结果如图7 所示，与PBS 组相比，3NO2Tyr11PD-L1 以及4NO2Phe11PD-L1 免疫后小鼠脾脏中的CD8+IFNγ+T 细胞比例均显著增加，但是3NO2Tyr11PDL 组CD8+IFNγ+T 细胞比例［（4.50 ±0.43）%］显著低于4NO2Phe11PD-L1 组［（6.97 ±0.78）%］。这可能是由于两者对CD4+T 细胞亚群的作用差异造成的。

Figure 6 Effect of 4NO2Phe11PD-L1 and 3NO2Tyr11PD-L1 immunization on the frequency of Th17 cells(±s,n=8)**P ＜0.01;ns:not significant

Figure 7 Effect of 4NO2Phe11PD-L1 and 3NO2Tyr11PD-L1 immunization on the frequency of CD8+T cells(±s,n=8)*P＜0.05, **P ＜0.01, ****P ＜0.000 1

4 讨 论

本研究利用遗传密码扩充技术，将两种免疫原性氨基酸4-硝基苯丙氨酸和3-硝基酪氨酸分别引入到PD-L1疫苗的相同位点，获得具有3-硝基酪氨酸以及4-硝基苯丙氨酸的两种PD-L1 突变体。遗传密码扩充技术中，非天然氨基酸由琥珀终止密码子TAG 编码，蛋白表达过程中，携带非天然氨基酸的tRNA 会和TAG 释放因子竞争结合TAG，因此，相较于原型蛋白，突变目的蛋白的产量较低，造成了后续纯化困难，其表达和纯化效率有待进一步提高。

研究发现4-硝基苯丙氨酸在PD-L1 疫苗中的引入，能够显著提高脾脏内Th1 细胞比例，同时Th2 细胞比例显著降低，促进Th1 细胞的极化。3-硝基酪氨酸在PD-L1 疫苗中的引入对Th1/Th2 比例无影响。有研究显示，肿瘤患者具有较低的Th1/Th2 比值，而相较于趋向于Th2 细胞反应的患者，趋向于Th1反应的患者主要表现出较高的生存率和较低的肿瘤复发率。因此，Th1/Th2 平衡向Th1细胞反应的转变有助于肿瘤的有效治疗［11］。

随后本研究分析了二者在PD-L1 疫苗中的引入对Treg 细胞比例的影响，4-硝基苯丙氨酸的在PD-L1疫苗中的引入显著降低Treg细胞的比例，而3-硝基酪氨酸的引入显著提高Treg 细胞比例。Treg 细胞是肿瘤免疫微环境中有效的免疫抑制细胞，特异性表达转录因子FOXP3，可通过分泌细胞因子（IL-10/TGF-β）或者细胞间的直接接触来抑制CD8+T 细胞使机体产生免疫耐受，维持机体稳态［12］。实验结果提示，机体可能把4-硝基苯丙氨酸的蛋白质作为外源蛋白处理，因此可能打破免疫耐受的能力更强。

值得关注的是，3-硝基酪氨酸的引入与4-硝基苯丙氨酸相比，能显著提高Th17 细胞的比例，而很早有文献发现在患有不同炎症相关疾病（例如急性肺损伤、心血管疾病和系统性红斑狼疮）的患者血浆中［13-15］，均可分离出识别3-硝基酪氨酸的免疫球蛋白，并且由于这些蛋白持续产生会激活免疫系统，因此可能在维持自身性免疫疾病中起作用。而Th17 细胞能够通过分泌炎症介质IL-17诱导严重的自身免疫反应［16-17］，上述结果提示，3-硝基酪氨酸可能在机体内作为一种炎症信号发挥作用。

本研究还分析了二者在PD-L1 疫苗中的引入对CD8+T 细胞的影响，它们均能有效地促进CD8+T 细胞的激活，但4-硝基苯丙氨酸在PD-L1 疫苗中的引入对CD8+T细胞的激活作用更强，这一结果与4-硝基苯丙氨酸的引入能显著提高Th1 细胞的比例相一致，提示4-硝基苯丙氨酸更适用于抗肿瘤疫苗的开发。