银杏叶提取物对4种口服抗凝药抗凝活性的影响

刘志双，郑玉粉，孙红娜，于 锋

（中国药科大学基础医学与临床药学学院，南京211198）

抗凝治疗是治疗血栓性疾病的基础，新型口服抗凝药（NOACs）的问世克服了传统维生素K 拮抗剂在血栓性疾病治疗的局限性，已显著改变了抗凝治疗现状并受到广泛关注［1-3］。目前在我国获批上市的NOACs 包括直接凝血酶（Ⅱa 因子）抑制剂达比加群酯（其在体内转化为具有直接抗凝血活性的达比加群），以及Xa 因子抑制剂阿哌沙班、利伐沙班和依度沙班。银杏叶提取物（GBE）作为活血化瘀类中药，已被越来越多的基础和临床实验证明对预防和治疗心脑血管疾病有益［4-5］，在国内外已广泛应用于心脑血管疾病的预防和治疗。

随着NOACs 在临床上的广泛使用，伴有多种血栓性疾病的患者可能出现同时服用GBE 和NOACs 的情况，然而临床上对于联合使用GBE 是否影响NOACs的抗凝活性提出疑问。目前国内外还尚未有关于GBE 和NOACs 间相互作用的研究报道。故本研究利用大鼠血浆体外研究GBE 联合4种NOACs（达比加群、阿哌沙班、利伐沙班和依度沙班）的抗凝效果，通过测定凝血时间（TT）、凝血酶原时间（PT）、部分活化凝血酶时间（APTT）和凝血因子Xa（FXa）活性评估GBE 对NOACs药效的影响，旨在初步探索GBE对NOACs的相互作用，以期为临床上NOACs的安全合理用药提供参考。

1 材 料

1.1 药品与试剂

达比加群（粉末，纯度95.4%）、阿哌沙班（粉末，纯度99.9%）、依度沙班（粉末，纯度99.9%）、利伐沙班（粉末，纯度99.7%）和银杏叶提取物（粉末，由银杏叶经乙醇回流提取、大孔树脂乙醇水溶液梯度洗脱而得，含24%银杏黄酮和6%银杏内酯）均购于上海源叶生物有限公司；凝血酶时间（TT）测定试剂盒（上海太阳生物有限公司）；凝血酶原时间测定液体试剂盒、活化部分凝血酶时间测定试剂盒（泰州中勤世帝生物技术有限公司）；大鼠凝血因子Xa（FXa）活性酶联免疫分析试剂盒（南京金霖生物有限公司）；其他试剂均为市售分析纯。

1.2 仪 器

BS124S 型电子分析天平（上海Sartorius Intec公司）；TDZ4A-WS型低速平衡离心机（湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司）；LG-PABER-I 半自动凝血因子分析仪（泰州中勤世帝生物技术有限公司）；VersaMaxTM酶标仪、SoftMax Pro v5.4 软件（美国Molecular Devices公司）。

1.3 动 物

SPF 级Sprague-Dawley 大鼠，体重（250 ± 20）g，雄性，由南京青龙山动物繁殖场提供，合格证号：SCXK（苏）2017-001。所有动物实验符合动物伦理委员会标准。

2 方 法

2.1 大鼠血浆采集与处理

大鼠禁食8 h 后，水合氯醛（10%，0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，劲动脉取血，血浆收集于含有109 mmol/L枸橼酸钠的试管中，枸橼酸钠和血浆以体积比1∶9的比例混合，轻轻颠倒混匀。收集的抗凝血浆以3 000 r/min 离心10 min，吸取上清液，即为待测血浆。所有血浆样品于室温下2 h 内进行测试，以确保其稳定性。

2.2 含药血浆配制

参照相关文献［6-9］，设置NOACs 在大鼠血浆中的终浓度为125、250、500 ng/mL，GBE 在大鼠血浆中的终浓度为125、250、500 μg/mL；根据实验结果，设置联合GBE 时NOACs 在大鼠血浆中的终浓度为125 ng/mL。

配制NOACs 和GBE 的DMSO 储备液，再用生理盐水配制成12.5、25、50 μg/mL 的NOACs 生理盐水溶液和12.5、25、50 mg/mL的GBE生理盐水溶液。将NOACs 或GBE 生理盐水溶液和大鼠血浆按体积比1∶99混合制备为所需浓度的含药血浆样品，用于NOACs 或GBE 对大鼠血浆凝血指标影响的实验，同时设置空白对照组，空白对照组使用生理盐水与大鼠血浆按体积比1∶99混合制备的血浆样品。将NOACs 生理盐水溶液、GBE 生理盐水溶液和大鼠血浆按体积比1∶1∶98混合制备为所需浓度的含药血浆样品，用于NOACs 联合GBE 对大鼠血浆凝血指标影响的实验，同时设置NOAC对照组和空白对照组，NOAC 对照组使用NOACs 生理盐水溶液、生理盐水和大鼠血浆按体积比1∶1∶98 混合制备的含药血浆样品，空白对照组使用生理盐水与大鼠血浆按体积比1∶49 混合制备的血浆样品。控制DMSO 在含药或空白生理盐水溶液中的体积分数小于0.1%，所有血浆样品现用现配。

2.3 凝血指标测定

2.3.1 TT、PT和APTT测定 使用TT、PT和APTT检测试剂盒于半自动凝血因子分析仪进行检测，设置仪器参数，测试杯的每个通道中加入搅拌珠，并将待测含药血浆（TT：100 μL，PT：50 μL，APTT：50 μL 和APTT 试剂50 μL）加入测试杯，放置37 ℃预温区预温3 min 后，将测试杯转入测试区，加入检测试剂（TT：TT 溶液100 μL，PT：PT 溶液100 μL，APTT：CaCl2溶液50 μL）的同时启动开始键，测定各凝血指标并记录结果。

2.3.2 FXa 活性测定 使用大鼠凝血因子Xa 活性酶联免疫分析试剂盒，将标准品稀释为2、4、8、16、32 U/L的标准溶液，酶标包被板设置标准孔、空白孔和待测样品孔，标准孔准确加入标准溶液50 μL，空白孔加入样品稀释液40 μL 和生理盐水10 μL，待测样品孔加入样品稀释液40 μL 和含药血浆样品10 μL，轻轻晃动混匀。用封板膜封板后置于37 ℃温育30 min 后，揭掉封板膜，弃去所有液体，每孔加满洗涤液重复洗涤5次，甩干液体后，除空白孔外其他孔加入酶标试剂50 μL，封板温育30 min 后洗涤5 次，加显色剂A 和B 各50 μL，轻轻振荡混匀后于37 ℃避光显色10 min，每孔加终止液50 μL 终止反应，在450 nm 波长下测定各孔的吸收度，通过标准曲线计算样品中FXa的活性。

2.4 数据处理

每个实验均独立重复6 次，所有数据应用SPSS 22.0 软件进行统计分析，结果以的形式表示，组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05视为有统计学差异。

3 结 果

3.1 NOACs对各凝血指标的影响

如表1所示，在0～500 ng/mL质量浓度范围内，TT、PT 和APTT 随NOACs 浓度增大而延长，除利伐沙班的TT 外，其余均具有较好的线性相关性（r2=0.78～0.98）。TT 对于达比加群异常敏感，相比于空白对照组，125 ng/mL 达比加群已显著延长TT约7 倍（P＜0.01）。TT 和APTT 的延长随着达比加群浓度增大趋于平缓。TT 对利伐沙班、阿哌沙班的灵敏度较低。达比加群在0～500 ng/mL 范围内延长PT 具有较好的线性相关性（r2=0.979 7）。PT 对阿哌沙班的灵敏度较低。依度沙班在0～500 ng/mL范围内延长APTT 具有较好的线性相关性（r2=0.982 2）。FXa 活性随Xa 因子抑制剂（指阿哌沙班、利伐沙班和依度沙班，下同）浓度增大而降低，在0～250 ng/mL 质量浓度范围内呈较好的线性相关性（r2=0.85～0.94），利伐沙班和依度沙班在高于250 ng/mL 时抑制作用趋于平缓。根据上述结果，选择NOACs 质量浓度为125 ng/mL 进行后续联合GBE的实验。

3.2 GBE对各凝血指标的影响

如表2 所示，GBE 在0～500 μg/mL 质量浓度范围 内 不 影 响 大 鼠 血 浆 的TT、PT 和APTT（P＞0.05），但随GBE 浓度增大而显著增强FXa 活性，具有较好的线性相关性（r2=0.840 4）。

3.3 GBE对NOACs各凝血指标的影响

如表3 所示，单独NOACs 存在时，相比于空白对照组，TT 显著延长（P＜0.01）。达比加群联合GBE 时，TT 随GBE 浓度增大而呈线性延长（r2=0.936 1），相比于达比加群对照组具有显著性差异。临床上TT延长超过3 s显示异常，达比加群联合125 μg/mL GBE 时，比达比加群对照组的TT 已延长约10 s，提示GBE 有抗凝的临床意义。利伐沙班联合GBE 时，TT 随GBE 浓度增大而缩短，但相比于利伐沙班对照组无显著性差异（P＞0.05）。阿哌沙班联合GBE 时，TT 随GBE 浓度增大而呈线性缩短（r2=0.799 7），相比于阿哌沙班对照组，联合500 μg/mL GBE 下的TT 具有显著性差异（P＜0.05）。依度沙班联合GBE 时，TT 随GBE 浓度增大而呈线性缩短（r2=0.810 9），相比于依度沙班对照组，联合250 μg/mL（P＜0.05）和500 μg/mL（P＜0.01）GBE下的TT具有显著性差异。

Table 1 Effects of new oral anticoagulants(NOACs)on coagulation indicators of rat plasma(±s,n=6)

Table 1 Effects of new oral anticoagulants(NOACs)on coagulation indicators of rat plasma(±s,n=6)

*P＜0.05, **P ＜0.01 vs 0 μg/mL group.TT:thrombin time;PT:prothrombin time;APTT:activated partial thrombin time;FXa:activated factor X

?

Table 2 Effects of Ginkgo biloba extract(GBE)on coagulation indicators of rat plasma(±s,n=6)

Table 2 Effects of Ginkgo biloba extract(GBE)on coagulation indicators of rat plasma(±s,n=6)

*P＜0.05, **P ＜0.01 vs control group

?

单独NOACs 存在时，相比于空白对照组，PT和APTT 延长，具有显著性差异。但NOACs 联合GBE 后的PT 和APTT 相比于NOAC 对照组没有显著变化（P＞0.05）。

单独Xa 因子抑制剂存在时，相比于空白对照组，FXa 活性显著降低（P＜0.05）。Xa 因子抑制剂联合GBE时，FXa活性相比于NOAC 对照组显著性增强，且随GBE 浓度增大而增强，具有较好的线性相关性（r2=0.88～0.92），变化趋势和单用GBE时相似，再次说明GBE具有显著增强FXa活性的作用。

4 讨 论

银杏叶在国内外地区分布广泛，是广泛使用的中药材，在国外也是非常受欢迎的膳食补充剂，具有抗血栓、抗氧化、扩张血管等作用［5］。目前在国内外已有大量关于银杏叶的研究，其生物活性成分的药理作用及抗血栓机制已有相关阐明［10-13］。

本研究通过TT、PT、APTT 和FXa 活性初步判断GBE 对凝血系统的影响，结果显示GBE 在0～500 μg/mL 范围内对TT 无显著性改变，表明GBE对凝血酶及纤维蛋白原无显著性影响。本研究结果显示GBE 对PT 和APTT 无显著性改变，GBE 联合NOACs 后的PT 和APTT 相比于NOAC 对照组也无显著变化，而FXa 活性随GBE 浓度增大而增强，根据凝血级联反应可知，FXa活性的增强会加速凝血酶的生成，这原本应该造成PT 和APTT 的缩短，可能GBE 增强的FXa 活性不足以造成PT 和APTT的显著缩短，又或者GBE 具有其他抗凝活性，如对蛋白C、蛋白S 或抗凝血酶有促进作用，从而抵消了其增强FXa活性的作用。

Table 3 Effects of NOACs combined with GBE on coagulation indicators of rat plasma (±s,n=6)

Table 3 Effects of NOACs combined with GBE on coagulation indicators of rat plasma (±s,n=6)

*P＜0.05,**P ＜0.01 vs control group; #P＜0.05,##P ＜0.01 vs NOAC single drug group(125 ng/mL)

Indicator Dabigatran Rivaroxaban Apixaban Edoxaban Group Control Single Combined with GBE Control Single Combined with GBE Control Single Combined with GBE Control Single Combined with GBE c/(μg/mL)125 250 500 125 250 500 125 250 500 125 250 500 TT/s 35.37±0.24 286.52±3.44**296.33±4.53#308.22±1.92##315.55±1.12##26.27±0.61 26.97±0.27*27.02±0.54 26.80±0.34 26.62±0.40 26.43±0.72 27.32±0.50*27.20±0.40 26.83±0.32 26.75±0.23#26.43±0.72 27.33±0.39*27.00±0.15 26.87±0.31#25.82±0.28##PT/s 13.87±0.16 18.30±0.77**18.00±0.41 17.92±0.43 17.82±0.26 15.03±0.28 15.57±0.19*15.62±0.31 15.43±0.26 15.48±0.19 15.95±0.24 16.42±0.26*16.18±0.34 16.63±0.46 16.43±0.23 15.95±0.24 17.95±0.26**18.07±0.37 17.93±0.26 18.03±0.24 APTT/s 26.97±0.22 57.35±0.72**56.90±0.52 57.62±0.93 57.93±0.72 47.40±0.67 51.48±0.58**51.17±0.70 50.02±0.51 51.25±0.97 34.17±0.28 39.18±0.38**38.82±0.23 38.88±0.29 39.03±0.22 34.17±0.28 37.87±0.45**37.52±0.53 37.78±0.40 37.95±0.37 FXa activity/(U/L)15.80±0.36 15.22±0.21*16.66±0.71#20.63±0.66##22.59±1.12##15.80±0.36 15.27±0.37*16.66±0.77#18.68±0.24#20.22±0.66##15.80±0.36 15.00±0.53*18.29±0.58##18.97±0.55##22.29±0.35##

本研究表明FXa活性随Xa因子抑制剂浓度增大而降低，在低浓度范围内（0～250 ng/mL）具有较好的线性相关性，这和相关文献的结论是一致的［14-17］，本研究发现GBE 具有增强FXa 活性的作用，这在中外文献中还未有相关的报道。本研究结果显示Xa 因子抑制剂联合GBE 后随GBE 浓度增大而缩短TT，但只在高浓度（500 μg/mL）GBE 下缩短的TT 具有统计学差异，这可能与高浓度GBE显著增强FXa 活性有关。而达比加群联合GBE 后随GBE 浓度增大而显著延长TT，这可能与达比加群是凝血酶的直接、强效的抑制剂有关，虽然GBE能增强FXa 活性，加速凝血酶的生成，但生成的凝血酶被达比加群所抑制，使GBE 增强FXa 活性的作用失效，而GBE 可能的抗凝活性发挥作用，协同达比加群使TT延长。

本研究与临床研究存在一定差异，首先本研究使用的是大鼠血浆，而凝血系统中的许多关键蛋白如活化凝血酶C 和蛋白S 的抗凝血活性具有物种特异性［18-19］，所以使用大鼠血浆和人体血浆在实验结果上可能存在差异；再者临床疗程一般为一个月，药物在体内经过较长时间的吸收代谢过程，对机体造成了一定的影响，而本研究只是在血浆中加入一定量的药物，这和复杂的体内药代动力学过程有较大的差异；最后，服药者的个体差异和健康状况或许也是影响实验结果的一个重要因素。因此GBE 及其联合NOACs 后对凝血系统的影响需在体内实验及临床试验中进一步研究。

本研究使用凝血指标TT、PT、APTT 和FXa 活性初步评估GBE 对NOACs 药效学的影响。实验结果提示GBE 可能协同达比加群的抗凝作用；而GBE可能拮抗Xa因子抑制剂（阿哌沙班、利伐沙班和依度沙班）的抗凝作用，原因可能是GBE 具有增强FXa 活性的作用。后续将在大鼠体内及人体血浆中进一步验证，并进行GBE 对NOACs 药代动力学研究，以明确GBE 对NOACs 药物相互作用，以期为临床联合使用GBE 和NOACs 的安全性和有效性提供理论参考。