作用于polo-box结构域的拟肽类polo样激酶1抑制剂的设计、合成及其生物活性

李芝艳，刘 婕，李冰艳，江 程*

（1中国药科大学江苏省药物分子设计与成药性优化重点实验室，南京210009；2中国药科大学蛋白质化学与结构生物学重点实验室，南京210009；3中国药科大学药学院药物化学系，南京210009）

Polo 样激酶家族（polo-like kinases，Plks）是一类结构上高度保守的丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶，在细胞周期进程中有重要的调控作用［1］。研究发现Plks主要有5种亚型，即Plk1，Plk2，Plk3，Plk4和Plk5［2］。人类Plks 中，Plk1-4 含有N末端激酶结构域（kinase domain，KD），以及一个或多个高度保守的C 末 端polo-box 结 构 域（polo-box domains，PBDs），而Plk5 不含N末端的KD 部分［2］。PBD 是Plks特有的结构，对Plks在亚细胞中的定位及对底物蛋白识别和磷酸化过程中起到重要作用［2］。

Plk1，Plk2 和Plk3 这3 种亚型的结构相似，而Plk4 与前三者差别较大［3-4］。Plk1 在多种肿瘤细胞中过度表达，抑制其功能可以引起肿瘤细胞凋亡并抑制肿瘤细胞的生长，但对正常细胞却没有明显影响，因此，Plk1 是新型抗肿瘤药物研发的一个有效靶标，目前也报道了多种Plk1 抑制剂［5-6］。然而，与Plk1 结构高度类似的两个激酶Plk2 和Plk3对保持基因的稳定及阻止细胞癌变具有重要作用，通常被认为具有抑制肿瘤生长的作用［7-9］。因此，在研究作用于Plk1 的抑制剂时，必须考虑如何高 选 择 性 地 抑 制Plk1 而 不 抑 制Plk2 和Plk3［9-10］。在Plk1 抑制剂中，研究最为广泛的是作用于ATP结合位点的ATP 竞争性小分子化合物，目前已有很多化合物进入临床研究（表1），作用于Plk1 PBD的ATP 非竞争性抑制剂也受到了越来越多的关注［11-12］。PBD 是Plks特有的结构，对Plk1在亚细胞中的定位及对底物的磷酸化过程中起到重要作用，不同亚型的Plk 磷酸化的底物不同，其PBD 的结合口袋也不相同，因此以Plk1 PBD 为靶点开发抑制剂，对于寻找高选择性的Plk1 抑制剂具有重要意义。

以从Plk1 的底物蛋白PBIP1 中截取的磷酸肽为模板，Lee等［13］报道了第1个五肽结构的高活性、选择性的Plk1 PBD 抑制剂PLHSpT（图1，化合物1）。此后，一系列拟肽结构的Plk1 PBD 抑制剂被报道出来（图1，化合物2～5）［14-19］。本课题组前期也报道了一些在结构中引入非天然氨基酸，获得高活性、选择性的拟肽结构的Plk1 PBD 抑制剂（图1，化合物6），这些抑制剂的血浆稳定性与PLHSpT相比也得到了较大提高［20-22］。

目前文献报道的高活性拟肽结构的Plk1 PBD抑制剂通常含有磷酸基团，并且这个磷酸基团被认为对于保持化合物的高活性起到了重要作用［12］。然而，磷酸基团通过磷酸酯键和拟肽化合物骨架相连，这个部分容易受到细胞中磷酸酯酶的破坏，同时，磷酸基的存在降低了化合物的细胞穿透性，大大降低了化合物对细胞的作用［18］。用一系列（2S，3R）-2-氨基-3-甲基-4-膦酰基丁酸（Pmab）掺入肽模拟物，得到的拟肽化合物保留了对Plk1 PBD 的高效抑制作用，同时还对磷酸酶十分稳定［18］。但是由于Pmab 合成难度非常大，给这类拟肽化合物的制备和使用带来了一定的局限。本研究将五肽中磷酸化的苏氨酸中的磷酸基替换为羧基，获得了一系列不含磷酸基团的拟肽化合物，为寻找新型的选择性Plk1 PBD 抑制剂提供了参考。

1 材 料

1.1 药品与试剂

Rink树脂（替代度SD=0.8 mmol/g）、9-芴甲基氯甲酸酯（Fmoc）、O-苯并三唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸盐（HBTU）、1-羟基苯并三唑（HOBt）和各种氨基酸均购自上海毕得医药科技有限公司；三氟醋酸（阿拉丁试剂）；N，N-二甲基甲酰胺（DMF，天津化学试剂厂）；FITC-Probe1（FITC-GPMQSpTPLNG-OH）、FITC-Probe2（FITC-GPMQSpTPKNG-OH）、FITC-Probe3（FITC-GPLASpTPKNGOH）购自上海沐晋生物有限公司；其他试剂均为市售分析纯；人类HeLa 细胞由中国药科大学基础医学与临床药学院提供。

1.2 仪 器

多肽合成反应管（北京欣维尔玻璃仪器有限公司）；振荡器（杭州奥盛仪器有限公司）；1100 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；岛津SPD-20A 制备液相色谱仪（日本岛津公司）；Thermo Scientific TSQ Quantis 液质联用仪（美国Thermo-Finnigan公司）。

Figure 1 Representative reported peptidomimetics as Plk1 PBD inhibitors

2 方 法

2.1 拟肽化合物的合成

目标化合物的合成采用的是文献报道的Fmoc保护基固相合成法［17］。目标化合物合成路线通式见图2。Rink 树脂用DMF 溶胀20 min，将Fmoc 保护的氨基酸（3.0 eq.）、HBTU（3.0 eq.）、HOBt（3.0 eq.）和N，N-二异丙基乙二胺（DIEPA，6.0 eq.）与DMF（1 mL）混合2 min，加入到树脂中，剧烈振荡1 h，减压抽滤掉反应液，再用DMF 和DCM交替洗涤树脂3 次后，加入配制好的封端液（DMF-醋酐-DIPEA，7∶2∶1）1 mL左右，在涡旋振荡仪上反应30 min，再重复上述洗涤操作。向混合物中加入事先配制好的Fmoc 脱保护溶液（DMF-哌啶，4∶1）2 mL，在涡旋振荡器上振荡反应10 min，减压抽滤掉溶液，再用DMF、DCM 交替洗涤3 次，再加入脱Fmoc 溶液2 mL，振荡15 min 后，重复上述洗涤步骤洗涤之后，用刮刀取少量置于试管中，加入几滴配制好的5%苯并茚三酮溶液，100 ℃水中煮沸2 min 后，树脂显蓝紫色则表示Fmoc 脱除完毕，如树脂显无色透明状，或者浅红色则需再加脱Fmoc 溶液，振荡，直到Fmoc 脱除完全，才可进行下步操作。用后续连接需要的不同“砌块”重复以上偶联-脱保护过程，直至完成所需拟肽链的合成。将合成结束后的树脂用DMF 洗涤2 次，减压抽滤掉DMF，尽可能地抽干溶液，然后加入冰三氟醋酸2 mL 左右，摇晃使溶液和树脂的颜色变红或变黑之后，再将其放置于涡旋振荡仪上振荡3～4 h，使其充分脱掉多肽上的保护基并从树脂上裂解完全。将裂解后的反应液缓慢滴入3～5 倍体积冷却的无水乙醚（0 ℃）中，将沉淀及无水乙醚倒入20 mL 离心管中，用转速2 500 r/min 的离心机，离心3 min 后，倒掉上层的无水乙醚，下层沉淀再加冰乙醚搅拌洗涤后，再对其离心，重复上述步骤，最后得到固体的粗肽。裂解沉降得到的粗肽用溶剂（超纯水-色谱级乙腈，1∶1）溶解，用0.45 μm 粒径的水滤膜对其进行过滤，得到的滤液用岛津反相高效制备液相仪对其进行分离纯化，流动相A 为超纯水溶液，流动相B 为含0.1%三氟醋酸的色谱级乙腈。目标物纯度经HPLC 检测均高于95%，高分辨质谱确定其相对分子质量（表1）。

2.2 目标化合物对Plk1的抑制活性

Figure 2 Synthetic route of target compound.“R”represents different amino acids or small molecule acids

Table 1 HRMS and purity data of the target compounds

采用荧光偏振法测定目标化合物对Plk1 PBD的抑制活性。将FITC-Probe1（60 nmol/L）与Plk1 PBD（300 nmol/L）以及不同浓度的待测试目标化合物各20 μL 依次加入384 黑色孔板中，先从高浓度到低浓度加待测试化合物，再从低浓度到高浓度加入Plk1 PBD（300 nmol/L）蛋白溶液，最后从低浓度到高浓度加入FITC-Probe1（60 nmol/L）探针溶液，每个浓度设立3个复孔。此外，需要加入FITCProbe1（60 nmol/L）标签溶液20 μL，再加缓冲液40 μL作为测试的空白对照，以及含有FITC-Probe1（60 nmol/L）标签溶液20 μL 和Plk1 PBD（300 nmol/L）蛋白溶液20 μL，再加缓冲液20 μL 的混合溶液作为阴性对照，空白对照孔与阴性对照孔都需要设置3个复孔，空白对照与阴性对照处理方法与每个化合物的处理方法一致。加完之后室温避光在台式摇床上缓慢振摇孵育30 min 后，在荧光偏振仪上进行偏振检测并进行数据分析，通过计算公式计算出目标化合物对Plk1 PBD 的抑制率。抑制率（%）=［1-（阳性对照偏振值- 空白对照偏振值）/（阴性对照偏振值-空白对照偏振值）］×100。再用GraphPad Prism 5 软件拟合抑制曲线并计算出目标化合物的IC50，实验结果见表2。

Table 2 Structures of designed compounds and inhibitory activity to Plk1 PBD(±s,n = 3)

Table 2 Structures of designed compounds and inhibitory activity to Plk1 PBD(±s,n = 3)

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2.3 化合物7l对Plk2、Plk3的抑制活性

化合物对Plk2 PBD 和Plk3 PBD 的抑制活性测试方法与Plk1 PBD 的抑制活性测试方法相同，只需将探针和标签分子换成相应的FITC-Probe2和FITC-Probe3即可。

2.4 目标化合物对HeLa细胞增殖的抑制活性

Plk1在HeLa细胞中高表达，因此选择HeLa细胞测试化合物对细胞增殖的抑制活性。将培养的HeLa 细胞以每孔2 500 个细胞加入到96 孔板中，然后加入不同浓度的待测化合物（0，100，200，300，400，500 μmol/L）100 μL，再加入细胞培养基进行培养。培养孵育24 h 后，每孔加入浓度为5 mg/mL 的3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基溴化四唑（MTT）溶液20 μL，继续培养4 h 后弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）100 μL。将该悬浮液置于微型振动器上振荡5 min 后，使用广谱酶标仪测定其在波长为570 nm处的吸收度（A）。实验重复3 次，最终结果取3 次结果的平均值。化合物对肿瘤细胞增殖抑制率通过下式计算：抑制率（%）=［（对照组吸收度-给药组吸收度）/对照组吸收度］×100。

2.5 大鼠血浆稳定性测试

将待测化合物与阳性药配制为100 μg/mL 的溶液，取0.1 mL 加入到新鲜的大鼠血浆1 mL 中，终浓度为10 μg/mL，混合均匀在37 ℃下恒温孵育。在不同时间点取孵育的混合溶液100 μL加入到溶剂（甲醇-乙腈，1∶1）300 μL 中，涡旋振荡后在4 ℃下以12 000 r/min离心20 min以沉降血浆蛋白。取上清液并用LC-MS 测定不同时间点大鼠血浆中残留的化合物含量。

LC-MS 分析是通过Thermo TSQ Quantis LC MS/MS 系统进行的，色谱分离使用InertSustain C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A是超纯水中含0.1%的甲酸溶液（A 泵），流动相B 是乙腈中含0.1%的甲酸溶液（B泵）。设定流动相梯度如下：0 min，5%B；8 min，30%B；8.2 min，80%B；9 min，80%B；9.1 min，5%B；15 min，5%B。流速为1 mL/min。所有样品的进样量为20 μL。正电喷雾电离（ESI）模式用于MS 测定，其源参数如下：喷雾电压，4 000 V；传输管温度为350 ℃；鞘气30 Arb；离子吹扫气体压力为1.0 psi（1 psi=6.895 kPa）。

2.6 分子对接研究

Plk1 PBD 蛋白结构从RCSB 的蛋白数据库中获得，网址为http：//www. rcsb. org/pdb/home/home.do，晶体结构ID 为3HIK。晶体结构首先用GOLD 5.1 软件进行结构优化，添加极性氢以及去除原晶体结构中的配体文件，保存为sdf 格式文件备用。小分子文件采用MOE 2019.01 优化，使用MMFF94x 力场进行能量优化。能量收敛到41.86 J/mol，最大迭代次数1 000 至优化结束，保存为sdf文件备用。对接采用CCDC GOLD v5.1 软件中的ChemScore 计算方法，活性位点定义为以配体分子几何中心为圆心、半径为8 Å 的球，遗传算法参数（GA）设置为10，采用ChemScore 打分函数并设定选择所有的对接构象，要求计算结果RMSD ＜1.5 Å。根据ChemScore 的打分、氢质子转移的可行性以及化合物与酶形成氢键综合挑选，获得最优对接构象。最佳构象用MOE 2019.01 做可视化图象。

3 结果和讨论

由表2可知，以PLHSpT为先导化合物，将结构中的磷酸基团替换为羧基，并考察羧基与拟肽骨架之间连接链的长度对活性的影响。当羧基与骨架之间的距离为2 个原子（化合物7b）时，化合物对Plk1 PBD 的抑制活性与先导化合物PLHSpT 相当，延长（如化合物7c）或缩短（如化合物7a）均引起活性下降。接下来，将肽链中组氨酸的咪唑基团用不同的杂环化合物进行替换，也就是将组氨酸残基用非天然氨基酸残基进行替换，所获得的化合物均保持了对Plk1 PBD 的抑制活性，选取化合物7i（咪唑环被噻唑环替换）进行进一步的探索。对N-末端的Pro-Leu 基团的修饰，参考本课题组前期研究工作［22］，引入了多种非天然的氨基酸取代基，大部分化合物表现出较高的Plk1 PBD 抑制活性，其中化合物7l（N-末端的取代基是4-羟甲基苯甲酰-D-β-天冬氨酰基）表现出最高的Plk1 PBD 抑制活性（IC50=0.285 μmol/L）。化合物7l的选择性测试结果如图3 所示，其对Plk2 PBD 和Plk3 PBD 的IC50均大于100 μmol/L，表现出显著的亚型选择性。

Figure 3 Inhibition of compound 7l to Plk1,Plk2,and Plk3 PBD（±s,n = 3）

先导化合物（PLHSpT，化合物1）在500 μmol/L下对HeLa 细胞增殖没有抑制作用，酶水平的抑制活性和肿瘤细胞增殖抑制活性之间的巨大差别由于磷酸肽对细胞膜较差的渗透性所导致［17］。化合物7l 对HeLa 细胞增殖的IC50为362 μmol/L（图4）。虽然化合物1 对Plk1 PBD 的抑制活性与化合物7l相当，但是对肿瘤细胞增殖的作用却远远低于化合物7l。这说明对拟肽化合物结构改造提高了化合物对肿瘤细胞生长的抑制作用。

Figure 4 In vitro cell toxicity of compound 7l on HeLa cells after 24 h incubation（±s,n = 3）

化合物的大鼠血浆稳定性实验结果如图5 所示，当孵育时间达到30 min 或者更久时，化合物7l的降解速度明显慢于阳性对照（PLHSpT，化合物1）。孵育到120 min 时，血浆中阳性对照PLHSpT的残留量为43.3%，而相比之下，化合物7l 的剩余量仍超过70%。PLHSpT 结构中全部是天然氨基酸，而改造得到的化合物7l 的结构中仅含有两个天然氨基酸残基，这样的非天然氨基酸修饰增加了拟肽化合物的血浆稳定性。

Figure 5 Plasma stability of PLHSpT (1) and compound 7l（±s,n = 3）

选取活性最好的化合物7l，将其进行对接研究，对接结果见图6。从分子对接图中可以看出，化合物7l 上C 端的羧基可以进入磷酸基结合口袋与Plk1 PBD 上的Lys540 产生静电相互作用，这与PLHSpT 类似。丝氨酸残基上的羰基和氨基与Trp414上的氨基与羰基产生氢键相互作用，β-D-天冬氨酸侧链的羧基与Plk1 PBD上的Arg516的胍基产生静电相互作用，这个作用力的增加可能是化合物7l 结构中虽然缺少了磷酸基这样强作用的基团却仍然能保持活性的主要原因。

Figure 6 Docking study on compound 7l with Plk1 PBD(A). Binding modes of compound 7l (yellow) and the co-crystallized ligand PLHSpT(cyan)(B), where consistent binding modes were found between compound 7l and PLHSpT in the crystal structure(PDB code 3HIK)

4 结 论

通过将磷酸肽结构的Plk1 PBD 抑制剂的磷酸基用羧基替换，并且将肽链中用各种非天然氨基酸进行改造和修饰，本研究获得了一系列不含磷酸基团的选择性Plk1 PBD 抑制剂。大部分化合物表现出对Plk1 PBD 的中等抑制活性，其中化合物7l 对Plk1 PBD 抑制活性与先导化合物PLHSpT 相当，且具有高选择性。与磷酸肽类结构化合物相比，改造后的化合物具有更好的肿瘤细胞生长抑制作用。并且，经过非天然氨基酸修饰和改造，化合物的血浆稳定性得到了提高。这类不含磷酸基团的拟肽类化合物的发现，为寻找新型的选择性Plk1 PBD抑制剂提供了参考。