阿奇霉素口服微球的制备及其评价

苏日娜，樊万君，张自强，何淑旺，姚 静*

（1中国药科大学药学院，南京210009；2南京泽恒医药技术开发有限公司，南京210046；3山东达因海洋生物制药股份有限公司，荣成264300）

阿奇霉素（azithromycin，AZI）是由红霉素衍生的半合成氮杂内酯类抗生素，对多种革兰阳性菌和革兰阴性菌有效［1］。临床上因其抗菌谱广、安全性好和易吸收等特点不仅广泛用于成人患者，还可用于婴幼儿患者。由于AZI味道极苦，给药剂量大，儿童患者适口性差，会导致服药不准确甚至治疗效果不佳。除具有苦味之外，AZI口服给药时还会出现恶心、痉挛、腹泻和呕吐等胃肠道不良反应［2］。因此，研究开发一种改善AZI 苦味，提高患者接受度与降低不良反应的制剂极为重要。

最近研究表明，稳定性好且便于贮存与携带的微型固体制剂更为适合儿科患者［3-7］，其中微球剂量灵活性高、载药量大，适合给药剂量大并具有不同给药方案的抗生素类药物。不仅如此，微球粒径范围小、易于吞咽，在一项不同粒径多微粒体系评价中，小粒径范围微粒服用需水量与口腔残留少，在成人与儿童群体中服用意愿与接受度更高［8］。与此同时，微球可通过载体材料的特性进行包衣，制备口腔速崩片等达到掩味、缓控药物释放，提高制剂灵活性，从而适合不同年龄段或不同吞咽能力患者。乙基纤维素（ethylcellulose，EC）是制备微球常用的可降解、生物相容性良好的缓释载体材料，可以减少口腔中药物释放而达到掩味效果，药物从EC 微球中的缓慢释放可降低胃肠道中药物浓度，从而降低药物的胃肠道不良反应［9-10］。

因此，本研究采用EC 为载体材料，以O/W 乳化溶剂挥发法制备阿奇霉素载药微球（AZI-EC MS），通过混合不同相对分子质量EC 为载体的简易方法解决其突释问题并初步探讨释药机制。确定AZI苦味阈值浓度，得出苦味评价拟合方程并评价AZI-EC MS 掩味效果，旨在制备改善AZI 苦味，提高患者顺应性的口服微球，为AZI 制剂研究与AZI苦味评价奠定基础。

1 材 料

1.1 药品与试剂

阿奇霉素原料药（湖北展望药业有限公司，纯度99%）；乙基纤维素［型号：AqualonTMT10（Mr75 kD）、N22（Mr140 kD）、N50（Mr160 kD），美国亚什兰公司］；甲醇（色谱纯，江苏汉邦科技有限公司）；其他试剂均为市售分析纯。

1.2 仪 器

岛津CTO-10ASUP高效液相色谱仪（日本岛津公司）；PB-10 pH 计（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；OS20-Pro 置顶式搅拌器（美国Scilogex 公司）；SHA-B 水浴恒温振荡器（精达有限公司）；ZRS-6G 智能溶出试验仪（天津天大天发科技有限公司）；DSC200F3 差示扫描量热仪（德国耐驰公司）；S-3400N扫描电镜仪（日本Hitachi公司）。

2 方 法

2.1 AZI-EC MS的制备

采用O/W 乳化溶剂挥发法制备AZI-EC MS。精密称取EC 0.5 g 溶于二氯甲烷10 mL，待其完全溶解后，精密称取AZI 0.5 g 加至上述溶液作为油相，匀速滴入至高速搅拌的0.1 % SDS 水相，搅拌挥发一定时间后，过滤冲洗微球，烘干至恒重后收集微球。连续过100 目和200 目筛取75～154 μm范围AZI-EC MS。

2.2 载药量的测定

色谱条件：C18色谱柱，流动相：0.1 mol/L 磷酸氢二钾（20%磷酸调至pH 8.2）-甲醇（25∶75），检测波长：210 nm，流速：1 mL/min，柱温：30 ℃，进样量20 μL。

精密称取适量AZI-EC MS 于2 mL 量瓶，加入二氯甲烷待溶解完全后定容至刻度，摇匀后精密移取1 mL 至10 mL 量瓶以流动相定容至刻度，过膜取续滤液进HPLC 测定。计算载药量：载药量（%）=所含药物重量/微球总重×100。

2.3 体外释放度测定

称取适量AZI-EC MS（含AZI 125 mg），以新鲜脱气磷酸氢二钠（pH 6.0）500 mL 为释放介质，温度（37±0.5）℃，转速100 r/min 测定释放度。于时间点0.5、1、3、6、8 h 取样5 mL 并补充同温同体积介质，过滤后取续滤液进HPLC 测定，绘制累计释药曲线。

2.4 EC-AZI MS表征

2.4.1 DSC 分析 取AZI、EC（T10）、EC（N22）、AZI 与EC（T10）和EC（N22）物理混合物（EC（N22）与EC（T10）质量比为7∶3，药载质量比为1∶1）、ECAZI MS（EC（N22）与EC（T10）质量比为7∶3，药载质量比为1∶1）样品约5 mg 于铝坩埚中，以升温速率10 ℃/min，升温范围30～300 ℃条件进行分析，绘制DSC曲线图。

2.4.2 FTIR 分析 分别将AZI、EC（T10）、EC（N22）、AZI-EC MS［EC（N22）与EC（T10）质量比为7∶3，药载质量比为1∶1］样品1～2 mg 在400～6 000 cm-1范围内进行分析，绘制红外光谱图。

2.4.3 SEM 分析 使用导电胶分别将空白微球［EC（N22）与EC（T10）质量比为7∶3］与AZI-EC MS［EC（N22）与EC（T10）质量比为7∶3，药载质量比为1∶1］固定在铜板上，金粉涂覆导电扫描并拍照，扫描电镜观察微球形态与表面。

2.4.4 体外模拟口腔pH 介质内释放研究 以经脱气处理的新鲜配制pH 7.4 磷酸氢二钠5 mL 为模拟口腔pH 的释放介质，介质温度为（37±0.5）℃，设恒温振荡器转速50 r/min，取药物/载体比例为1∶1、2∶1和3∶1处方载药微球以及AZI原料药（pure drug）适量（含AZI 125 mg）进行体外释放实验。于1、3 和5 min 分别取液1 mL 并及时补充相同体积等温介质，样品经0.22 μm 水系滤膜，取续滤液适量加流动相稀释后进HPLC测定。

2.4.5 AZI 阈值测定与苦味评价 取适量AZI 原料药粉末，以纯净饮用水配制4.97、9.93、14.9、19.9、29.8、48.5和99.3 μg/mL等一系列质量浓度后，由7 位19～25 岁健康成人志愿者组成的小组进行AZI 人体苦味阈值测试。要求志愿者以纯净水漱口后，取适量AZI 溶液含至口腔中，并将舌头左右前后转动至溶液与舌苔充分接触，30 s后吐掉并用纯净水漱口数次，同法依次测试浓度递增的AZI 溶液。志愿者对不同浓度AZI 溶液的苦味意见根据苦味量表评分。苦味量表由0 为“无味”、1为“微苦”、2 为“中苦”和3 为“强烈苦味”4 种标准组成。记录志愿者评分并确定AZI苦味阈值。

为得到苦味评分与AZI浓度之间的数量关系，将所得志愿者平均评分与AZI 浓度对数作多项式拟合［11］，得到lgC（AZI）与志愿者评分之间的关系。在此多项式拟合方程结果下，根据模拟口腔pH 条件下进行的释放度测定结果进行苦味评价计算。

3 结果与讨论

3.1 AZI-EC MS的制备

以EC（T10）、EC（N22）、EC（N50）等不同相对分子质量EC 为载体，制备载药微球。当药载质量比1∶1 时，分别以T10、N22 和N50 型号EC 为载体制 得 微 球 的 载 药 量 依 次 是（42.57±1.71）%、（47.66±0.85）%和（49.10±1.87）%。另外，如图1-A 所示，EC 相对分子质量会影响微球释药速率；其中EC（T10）微球在0.5 h突释率可达85%，1 h释放量达到90%以上，而EC（N22）型在各个时间点释放量均高于EC（N50），8 h 释放量分别为62%和54%。这说明EC相对分子质量能够影响微球释药行为，相对分子质量越大，药物释放越缓慢，这可能是因为随着聚合物相对分子质量增加，其链长增加，导致更强的韧性，使载药微球中的药物与载体更为紧密。

进一步制备以不同比例混合EC（N22/T10）为载体，药载质量比为1∶1 的微球，其释药结果如图1-B 所示，随着EC（T10）比例降低，其释药速率变慢，EC（N22）/EC（T10）比例5∶5和6∶4微球在0.5 h释放量将近80%，3 h 释放量可达到90%，而比例7∶3 和9∶1 的0.5 h 均未突释，8 h 释放量分别可达90%和60%左右。不同型号EC 的混合比例对载药量无明显影响。而以EC（N22/T10，7∶3）为载体的微球随药载质量比提高，微球释药速率与载药量增加（如图1-B和图1-C所示）。

Figure 1 Effect of molecular weight of ethylcellulose(EC) and ratio of azithromycin(AZI)/EC on cumulative drug release(A and B) and drug loading efficiency of AZI-EC microspheres(MS)(C)(±s,n=3)**P＜0.01; a formulation with AZI/EC ratio(1∶1); b formulation with EC(N22/T10,7∶3)

综合考虑突释（0.5 h释放量小于40%）和累计释放百分率（8 h 内释放量可达90%），确定药载质量比为1∶1，以混合EC（N 22/T 10，7∶3）为载体制备AZI-EC MS。

3.2 释药机制研究

缓释微球释药原理主要包括溶出、扩散、溶蚀等。扩散原理又包括透膜扩散（零级释放）、膜孔扩散（接近零级）和骨架材料扩散（非零级释放，Higuchi扩散模型）。将微球释药曲线与零级释放、Hixson crowell 溶蚀模型、Baker-lonsdale 球形扩散模型和Higuchi 扩散模型等释药模型方程进行拟合，讨论微球释药机制。如表1 所示，微球释药过程与零级释放模型拟合程度均较差；而EC（N22）、EC（N 22/T 10，9∶1）处方为Baker-lonsdale 球形扩散模型拟合度相对高，其余均与Higuchi 扩散模型拟合相对高，这说明微球释药是通过骨架材料扩散而非透膜扩散，药物通过EC 骨架孔道以浓度梯度为驱动进行释放。

Table 1 Fitting results of the in vitro release data to various release kinetic models from different microsphere formulations

3.3 AZI-EC MS表征与性质评价

3.3.1 DSC和FTIR 分析 DSC分析结果如图2-A所示，EC（N22）和EC（T10）在53 ℃处有吸热峰，AZI 原料药在128 ℃与253 ℃处有明显吸热峰，物理混合物则分别出现AZI、EC（N22）和EC（T10）的特征吸热峰，而AZI-EC MS 在128 ℃与253 ℃处未见AZI 特征吸热峰，且53 ℃处载体特征吸热峰有变 宽 趋 势；FTIR 结 果 如 图2-B 所 示，AZI 在1 725.1 cm-1处有羰基伸缩振动，而AZI-EC MS 光谱与EC（N22）和EC（T10）红外光谱相似，并且在1 729.6 cm-1出现AZI 羰基伸缩振动，有变宽趋势。上述结果说明，AZI-EC MS 中EC 与AZI 没有形成新化学键，但是存在分子间作用力。

3.3.2 SEM 形态观察 如图3 所示，空白微球与AZI-EC MS 整体成球效果均良好，形态相似，且粒径较均匀，而相比空白微球，AZI-EC MS 表面较粗糙，但仍未观察到药物结晶析出，这可能是由于药物的加入，使载体之间的作用有所改变而导致的。此外，放大后观察球表面结构（图3-C 和3-F），结果显示，由于在微球过程中溶剂挥发，在空白微球与AZI-EC MS表面均有大量的微小孔洞，而得益于这些孔洞，药物以浓度梯度为驱动力扩散释放。

Figure 2 DSC traces（A）and FTIR spectra（B）of AZI-EC MS(a),EC（N22）(b),EC（T10）(c),AZI(d)and physical mixture(e)

Figure 3 Typical SEM images of blank EC MS (A),single blank EC MS (B),surface of blank EC MS (C),AZI-EC MS (D)singleAZI-EC MS(E),surface of AZI-EC MS(F)

3.3.3 体外模拟口腔pH 内释放分析 接近唾液实际体积和pH 的释放介质能够更好地模拟口腔环境。一般唾液pH 范围在5.5～7.4 之间，其中，1～12 月小儿唾液pH 范围为5.7～7.0，大于pH 7.0时与小孩和成人唾液呈密切相关［12］。因此，本实验采用pH 7.4磷酸盐缓冲溶液为释放介质。如图4 所示，与原料药相比，在药物/载体比例高达3∶1时，AZI-EC MS在5 min时释药量仍低于5%，说明微球明显阻滞了药物在口腔中的释放，有助于提高适口性。

3.3.4 AZI 阈值测定与苦味评价 志愿者评价AZI 原料药苦味结果如图5-A 所示，在本实验条件下AZI人体苦味阈值浓度为9.93 μg/mL，等于或低于该浓度时口腔内口感为无味。

Figure 4 Dissolution profiles of different drug/polymer ratio EC microspheres,37°C,pH 7.4 dissolution medium(±s,n=3)

Figure 5 Taste scores assigned by human volunteers to different azithromycin solutions(A) and the polynomial relationship with calculation score of pure drug and AZI-EC MS formulations(B)

为得到志愿者评分与AZI 浓度之间的数量关系，将所得志愿者平均评分与AZI浓度对数作多项式拟合，得到lgc（AZI）与志愿者评分之间拟合方程为：Y=0.848 6X2-0.353 1X-0.411（R2=0.976 6）。其中，Y为苦味得分，X为lgc（AZI）。

根据该多项式拟合方程，分别利用AZI、不同药载质量比处方微球在pH 7.4 介质内1 min 时的释放浓度计算苦味得分。多项式拟合曲线与计算结果如图5-B 所示，AZI 在1 min 内释放药物浓度高，其苦味评分远远高于强烈苦味值，而载药微球即使在药载质量比为3∶1 情况下也远低于AZI 的苦味程度，且随着药载质量比的降低，其苦味程度降低，其中在药载质量比为1∶1 时口腔内停留1 min 时释药浓度可介于微苦程度，掩味效果良好。

4 结 论

改善苦味与服药顺应性在提高患者接受度及治疗效果方面具有重要意义。一项针对800 多名儿科医生的调查报告显示，90.8%的急性病患者和83.9%的慢性病患者的依从性障碍主要是由药物不良口感引起的［3］。患者接受度与口感有关之外，还与可吞咽性相关，如制剂体积、给药量和剂型均会影响可吞咽性。因此，本实验针对剂量大且具强烈苦味的AZI，采用EC为载体，以O/W 乳化溶剂挥发法制备AZI-EC MS 微球，其载药量高、剂量灵活性好、易于吞服、掩味效果良好。AZI-EC MS 制备方法简单，可有效控制药物释放和改善AZI 适口性，能够明显提高患者用药顺应性，为该类新剂型研究奠定基础。