不同抑菌剂对青稞鲜湿面中蜡样芽孢杆菌的抑制作用

王舒叆，王子元,2，张 敏,2,*

（1.北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京工商大学，北京 100048；2.北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京工商大学，北京 100048）

面条作为我国的传统主食之一，是一种制作简单、食用方便、营养丰富的食品。随着人们生活水平的提高，“鲜湿面”应时而生[1-3]。近年来，杂粮鲜湿面也逐渐成为消费者所追捧的对象，其能为消费者提供丰富的营养以及特别的口感、滋味。然而鲜湿面含水量高，水分活度大，在室温下极易腐败变质[4]。本课题组前期对青稞鲜湿面进行16S rDNA高通量测序发现，在青稞鲜湿面贮藏期间，芽孢杆菌属为优势腐败菌群[5]。近年来，蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）已逐渐被认为是一种通过生产肠毒素而导致胃肠疾病的致病性细菌[6-7]。蜡样芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种革兰氏阳性菌，兼性需氧，广泛分布于土壤、灰尘和污水中，也是食品中常见的污染菌和条件致病菌[8-10]。食品中蜡样芽孢杆菌数量超过5（lg（CFU/g））时即可导致呕吐和腹泻[11]。如何抑制青稞鲜湿面中蜡样芽孢杆菌的生长已成为青稞鲜湿面生产加工中的一项亟待解决的问题。

目前，除常用的一些保鲜剂外，肉桂醛、表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）和乳酸链球菌素（Nisin）等天然化合物也逐渐成为具有应用前景的保鲜剂研究对象。肉桂精油已被证明在肉制品及乳制品的保鲜应用中有良好的抑菌效果[12]，周小伟[13]通过肉桂醛熏制鲜湿面从而达到抑菌保鲜的目的。EGCG不仅对于引起食品腐败变质的革兰氏阳性菌有较好的抑制效果，同时能在食物体系中起到良好的抗氧化性[14]；Feng Lifang[15]和Li Tingting[16]等将茶多酚溶液涂抹在黑鲷和大黄鱼的表面再进行冷藏，能使其货架期分别延长6 d和8 d；骆晓波[17]研究显示EGCG纳米脂质体能延长鳕鱼的保鲜时间，具有广阔的市场潜力。Nisin作为一种理想的天然、高效食品防腐剂也因其对革兰氏阳性菌具有较好的抑制效果，被广泛应用于乳制品、肉制品及豆制品等高蛋白食品的保鲜研究[18-19]。毛汝婧[20]通过将Nisin与其他抑菌剂复配达到延长鲜湿面贮藏期的目的。可见，上述3 种抑菌剂均能起到一定的食品保鲜作用。但是，将上述3 种抑菌剂作为配料添加至青稞鲜湿面中，并探究其对面制品内特定菌（蜡样芽孢杆菌）的抑制效果的研究鲜有报道。

根据GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》，Nisin在方便面制品中的最大添加量为0.25 g/kg（0.025%），肉桂醛和EGCG无明确规定添加量。本研究拟对比分析同一添加量（0.025%）的3 种抑菌剂，以及0.05%的肉桂醛和EGCG对青稞鲜湿面中蜡样芽孢杆菌的抑菌效果。通过对室温（25 ℃）条件下贮藏的青稞鲜湿面中蜡样芽孢杆菌菌落数的分析及青稞鲜湿面产品的质构和色泽的测定，评判这3 种抑菌剂在青稞鲜湿面产品中的应用潜力。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘北青3号’青稞（蛋白质量分数9.57%、水分质量分数12.2%）购自山西东方亮生命科技有限公司；金沙河小麦粉（蛋白质量分数12.87%、水分质量分数13.11%）、不加碘食盐购自当地零售超市。

胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠 上海麦克林生化科技有限公司；盐酸 福晨（天津）化学试剂有限公司；无水乙醇 北京化工厂；胰蛋白胨大豆琼脂（tryptic soy agar，TSA）培养基 北京奥博星生物技术有限公司；肉桂醛（纯度95%）、EGCG（纯度90%）、Nisin A（纯度900 IU/mg） 上海源叶生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

IMDT168实验面条机、JHMZ200和面机 北京东孚久恒仪器技术有限公司；TMS-Pilot物性分析仪 美国FTC公司；BCL-1360A超净工作台 北京亚太克隆仪器技术有限公司；DHP-9162恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；THZ-83A恒温水浴振荡器 天津市泰斯特仪器有限公司；CR-400/410色差仪 日本柯尼卡美能达公司；WF-20B高效粉碎机 南京科益机械设备有限公司；SLG30-IV双螺杆挤压机（模口直径0.39 cm、长径比为23∶1） 济南赛百诺科技开发有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌悬液的制备

蜡样芽孢杆菌为北京工商大学粮油加工实验室前期在青稞鲜湿面中分离、纯化及鉴定的保藏菌种，将蜡样芽孢杆菌单菌落接种至100 mL LB液体培养基中，在37 ℃恒温摇床中以150 r/min连续振荡培养13 h后，吸取10 mL蜡样芽孢杆菌培养液，8 000 r/min离心10 min，收集沉淀，加入2 mL无菌生理盐水使菌体复悬，制成2 mL的蜡样芽孢杆菌悬液，于4 ℃冰箱贮藏并在1 d之内使用。

1.3.2 抑菌剂的制备

肉桂醛、EGCG、Nisin于2～8 ℃贮藏。肉桂醛、EGCG溶解于体积分数15%乙醇溶液，Nisin溶解于0.02 mol/L的HCl溶液，分别制成10 mg/mL的抑菌剂母液[21]。3 种抑菌剂用0.2 μm过滤膜过滤消毒，于4 ℃冰箱贮藏并在1 d内使用。

1.3.3 最小抑菌浓度的测定

将蜡样芽孢杆菌制成6～7（lg（CFU/mL））的菌悬液，实验设置阳性对照（加菌液）、阴性对照组（不加菌液）和抑菌剂实验组，每组均设3 组平行实验，共90 孔。实验组为100 μL新鲜LB液体培养基分别与100 μL的3 种抑菌剂混匀，用二倍稀释法使3 种抑菌剂分别由高至低配成一定的质量浓度梯度（4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625、0.007 812 5 mg/mL）[22]；阳性、阴性对照组为200 μL新鲜LB液体培养基按照二倍稀释法稀释。实验组与阳性对照组每孔加入100 μL蜡样芽孢杆菌悬液吸打混匀，阴性对照组每孔再加入100 μL新鲜LB液体培养基。将96 孔板放在37 ℃恒温培养箱中培养24 h后，观察96 孔板中能明显看到LB液体培养基不浑浊（且阳性对照孔内的蜡样芽孢杆菌正常生长，液体培养基浑浊）的孔所对应的抑菌剂的最小质量浓度即为该抑菌剂的最小抑菌浓度（minimal inhibit concentration，MIC）。

1.3.4 青稞粉的制备

未挤压青稞粉：WF-20B高效粉碎机过80 目筛粉碎青稞籽，再过120 目二次粉碎得水分质量分数为7.70%的未挤压青稞粉。

挤压青稞粉：用去离子水将未挤压青稞粉的水分质量分数调整至17%并充分搅拌均匀，静置24 h。采用SLG30-IV双螺杆挤压机预热30 min后，进行挤压膨化（挤压工艺参数为：螺杆转速260 r/min；筒体I区40 ℃、II区70 ℃、III区100 ℃、IV区150 ℃），挤压后再经WF-20B高效粉碎机过120 目筛制得挤压青稞粉[23]。

1.3.5 青稞鲜湿面的制作及接种

青稞鲜湿面制作工艺：按m（挤压青稞粉）∶m（未挤压青稞粉）∶m（小麦粉）＝1∶1∶3称料混匀，在800 W微波炉中微波杀菌40 s[24]，再加入一定比例无菌去离子水（溶解了原料粉总质量1%的食盐，并加入2 mL蜡样芽孢杆菌菌悬液）后放入和面机中和面6 min，得到目标水分质量分数为36%的面絮，装入自封袋密封，在30 ℃恒温下静置30 min醒面，再采用面条机将醒发好的面絮压制成厚度为1.5 cm的面片并切成宽度为2 cm的面条，最后每25 g面条放入一个自封袋中密封备用，所得青稞鲜湿面中初始蜡样芽孢杆菌菌落总数达到5～7（lg（CFU/g））。对于肉桂醛和EGCG实验组，设置在青稞鲜湿面中抑菌剂的添加量分别为0.025%（MIC）、0.05%（2 MIC），以添加15%乙醇为对照组；对于Nisin实验组，设置在青稞鲜湿面中抑菌剂的添加量为0.025%（MIC）（因为GB 2760—2014限制其添加量不超过0.025%，因此不探究0.05%添加量），以添加0.02 mol/L盐酸溶液为对照组。所有实验组均以不添加制剂为空白对照组。所有样品在25 ℃条件下贮藏。数据采自3 次独立重复的平行实验。

1.3.6 蜡样芽孢杆菌总数测定

按照GB/T 4789.2-2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》方法测定样品贮藏0、6、12、24 h和36 h时的蜡样芽孢杆菌总数，选用TSA培养基进行微生物分析。

1.3.7 质构特性测定

采用物性分析仪对青稞鲜湿面样品进行质地剖面分析（texture profile analysis，TPA）测定，测定速率48 mm/min，探头回升高度为15.00 mm，形变量为70%[25]，感应力为0.05 N，两次压缩间隔为1 s，测定的质构指标包括硬度、弹性、内聚性和咀嚼性，每个样品重复测定6 次，除去最大值和最小值，取平均值[26]。数据采自3 次独立重复的平行实验。

1.3.8 色泽测定

选取切条之前压延好的青稞鲜湿面片作为样品，采用色差仪测定样品的L*值（亮度）、a*值（红绿度）、b*值（黄蓝度）[27]。每个样品重复测定5 次，除去最大值和最小值，取平均值。数据采自3 次独立重复的平行实验。

1.4 数据统计与分析

数据均采用Excel和SPSS 19.0软件处理，选择Duncan检验在P＜0.05水平上对数据进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 3 种抑菌剂的最小抑菌浓度

表1 抑菌剂对蜡样芽孢杆菌作用24 h的最小抑菌浓度Table 1 Minimum inhibitory concentrations of antimicrobial agents against Bacillus cereus after 24 h exposure

由表1可知，3 种抑菌剂对蜡样芽孢杆菌的MIC均为0.025%，这与Cetin-Karaca等[28]的研究结果相符。结合GB 2760—2014推荐添加量，肉桂醛和EGCG抑菌效果采用0.025%（MIC）及0.05%（2 MIC），Nisin抑菌效果采用0.025%（MIC）进行后续实验分析。

2.2 3 种抑菌剂对蜡样芽孢杆菌的抑制效果

图1 25 ℃下0.025%（A）、0.05%（B）肉桂醛和EGCG对青稞鲜湿面中蜡样芽孢杆菌的抑制作用Fig. 1 Inhibitory effect of cinnamaldehyde and EGCG at 0.025% (A)and 0.05% (B) each on Bacillus cereus inoculated in fresh wet noodles incorporated with highland barley stored at 25 ℃

由图1A可知，在0～6 h内，蜡样芽孢杆菌菌落数呈现减小趋势，这可能是微生物在适应新环境的初期所产生的滞后现象[29]，36 h贮藏期内，空白对照组的菌落数显著增长了1.36（lg（CFU/g））；0.025% EGCG组中蜡样芽孢杆菌菌落数增加了1.30（lg（CFU/g）），贮藏末期与乙醇对照组和空白对照组无显著差异；而0.025%肉桂醛组中蜡样芽孢杆菌菌落数仅增加0.84（lg（CFU/g）），其生长速率与其他组相比明显延缓；贮藏36 h时与对照组（“对照组”菌落数为空白对照组与乙醇对照组的平均值，下同）相比，0.025%肉桂醛组的蜡样芽孢杆菌菌落数显著降低0.64（lg（CFU/g））。因此，0.025%肉桂醛显著抑制了蜡样芽孢杆菌的生长，而0.025% EGCG并没有显示出抑菌活性。黄敏欣等[30]在综述中阐明，肉桂醛在较低的抑菌浓度下，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌具有良好的抑制效果。

由图1B可知，在整个贮藏期内，空白对照组中蜡样芽孢杆菌显著增长了1.77（lg（CFU/g）），0.05%肉桂醛组蜡样芽孢杆菌菌落数显著减小了0.7（lg（CFU/g）），0.05% EGCG组显著减小了0.58（lg（CFU/g））。在贮藏终点，0.05%肉桂醛和0.05% EGCG组蜡样芽孢杆菌菌落数分别为4.96（lg（CFU/g））和5.38（lg（CFU/g）），分别比对照组减小了2.49（lg（CFU/g））和2.07（lg（CFU/g））。周小伟等[31]研究发现，0.05%的肉桂醛可完全抑制从鲜湿面中分离出的革兰氏阳性芽孢杆菌的生长；辛敏等[32]研究发现，茶多酚（EGCG为其主要成分）对枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌等革兰氏阳性菌有着良好的抑制效果，且与其浓度呈正相关。0.05%肉桂醛和0.05% EGCG对蜡样芽孢杆菌的抑制活性明显高于低剂量（0.025%）的抑制活性，能显著抑制青稞鲜湿面中蜡样芽孢杆菌的生长，且肉桂醛的抑菌活性要高于EGCG。Cetin-Karaca等[28]研究发现，0.05%肉桂醛和0.05% EGCG均可显著抑制重组婴儿米糊中蜡样芽孢杆菌的生长。

图2 25 ℃下0.025% Nisin对青稞鲜湿面中蜡样芽孢杆菌的抑制作用Fig. 2 Inhibitory effect of 0.025% Nisin on Bacillus cereus inoculated in fresh wet noodles incorporated with highland barley stored at 25 ℃

由图2可知，在整个贮藏过程中，空白对照组的蜡样芽孢杆菌菌落数显著增加了1.39（lg（CFU/g））；而添加0.025% Nisin的青稞鲜湿面中的蜡样芽孢杆菌菌落数仅增加了0.96（lg（CFU/g））。贮藏期内，0.025% Nisin组的菌落数一直显著低于空白对照组和HCl对照组，在贮藏终点比对照组显著低0.83（lg（CFU/g））。侯亚文等[33]研究表明，Nisin能对许多引起食品腐败的革兰氏阳性菌，特别是芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌等产芽孢的细菌产生较强的抑制效果。但是Nisin的抑菌效果受食品成分和环境影响较大，食品中的许多组分都能影响其抑菌活性[34]。

在青稞鲜湿面中，蜡样芽孢杆菌的平均初始数量为5.86（lg（CFU/g）），0.025%肉桂醛和Nisin均可使蜡样芽孢杆菌得到不同程度的抑制，但不能完全抑制其生长，0.025% EGCG对青稞鲜湿面中的蜡样芽孢杆菌无显著性影响；而添加0.05%的肉桂醛和EGCG均可显著抑制蜡样芽孢杆菌的生长。结合GB 2760—2014中规定的最大添加量的限制，在25 ℃贮藏条件下，肉桂醛对青稞鲜湿面中蜡样芽孢杆菌的抑制效果最好。

2.3 3 种抑菌剂对青稞鲜湿面质构的影响

根据TPA结果，25 ℃贮藏条件下，贮藏36 h内，添加0.025%的3 种抑菌剂的青稞鲜湿面与空白对照组、乙醇对照组及HCl对照组比较，其硬度、弹性、内聚性和咀嚼性均无显著性差异（数据未列出）。表2为添加了0.05%肉桂醛和0.05% EGCG的青稞鲜湿面质构特性随着贮藏时间的变化结果。在25 ℃下贮藏12 h后，肉桂醛、EGCG组的青稞鲜湿面硬度比对照组显著增加了3.34 N和3.11 N；贮藏24 h后，分别添加0.05%肉桂醛和0.05% EGCG的青稞鲜湿面比对照组显著增加了7.29 N和4.94 N。

表2 25 ℃下0.05%抑菌剂对青稞鲜湿面质构品质的影响Table 2 Effect of each bacteriostatic agent at 0.05% on the texture of fresh wet noodles incorporated with highland barley stored at 25 ℃

贮藏12 h后，添加0.05%肉桂醛和0.05% EGCG的青稞鲜湿面咀嚼性比对照组分别显著增加了3.345 mJ和3.675 mJ；而贮藏终点36 h时实验组与对照组之间无显著差异。空白对照组在贮藏期内的咀嚼性先下降后上升，而0.05%肉桂醛和0.05% EGCG组在36 h贮藏期内均无显著变化，证明0.05%肉桂醛和0.05% EGCG可在样品贮藏12～24 h期间内提高其咀嚼性。

分别添加0.05%肉桂醛和0.05% EGCG的青稞鲜湿面与两种对照组比较，其弹性和内聚性均无明显差异，在36 h贮藏期内所有样品弹性呈整体减小趋势，内聚性变化不明显。

胡刘岩[35]研究发现，经肉桂醛处理过的冷鲜肉硬度、弹性、黏结性、胶着性、咀嚼度均比对照组好；还有研究发现肉桂醛纳米液处理牛肉饼对其质构有显著的改善作用[36]。胡思[37]研究表明，茶多酚可与环境中的蛋白质结合形成稳定性较强的交联网状结构，可达到提升鲜湿面质构品质的作用。综合硬度、弹性、内聚性和咀嚼性的质构特性分析，与两个对照组相比，0.05%肉桂醛和0.05% EGCG可在12～24 h贮藏期内提高青稞鲜湿面的硬度，在贮藏12 h时提高其咀嚼性。

2.4 3 种抑菌剂对青稞鲜湿面色泽的影响

在25 ℃贮藏36 h，分别添加0.025% 3 种抑菌剂的青稞鲜湿面与空白对照组、乙醇对照组以及HCl对照组比较，其L值、a*值和b*值均无显著性差异，且随着贮藏时间的延长，所有样品的L*值和b*值均呈现下降趋势，a*值呈现上升趋势（数据未列出）。

表3 25 ℃下0.05%抑菌剂对青稞鲜湿面色泽的影响Table 3 Effect of each antibacterial agent 0.05% on the color of fresh wet noodles incorporated with highland barley stored at 25 ℃

表3显示添加了0.05%肉桂醛和0.05% EGCG的青稞鲜湿面色泽在贮藏过程中的变化结果。在贮藏期内所有样品的L*值均显著下降。贮藏12 h后，0.05%肉桂醛和0.05% EGCG组与空白对照组和乙醇对照组相比均显著提高了青稞鲜湿面的亮度，贮藏至36 h时，肉桂醛组青稞鲜湿面亮度最高，与对照组相比其L*值提高了5.295；0.05% EGCG处理组与对照组相比其L*值提高了2.915。

在贮藏过程中，所有样品的a*值均显著增加。贮藏至36 h时，0.05%肉桂醛和0.05% EGCG组a*值与对照组相比分别降低0.41和0.59。

在贮藏期内，除肉桂醛组b*值无显著性变化，其他组样品b*值均显著下降。肉桂醛组贮藏至36 h其b*值与对照组相比显著增加2.44，可能与肉桂醛乙醇溶液呈淡黄色有关；而0.05% EGCG组青稞鲜湿面的b*值与两个对照组之间无显著差异，说明其对青稞鲜湿面的b*值无显著影响。温小礼[38]的研究表明，5 μL/L的肉桂醛熏蒸处理香菇，不仅可提高其抗坏血酸、超氧化歧化酶和谷胱甘肽还原酶等相关抗氧化物酶的活力，还能提高香菇清除自由基的能力及总抗氧化能力，从而达到护色的效果。因此，肉桂醛可能因为其较强的抗氧化性抑制了青稞鲜湿面中的酶促褐变反应，从而达到提升亮度、黄蓝度的效果，进而起到护色保鲜的作用。

综合L*值、a*值、b*值分析结果，在25 ℃下贮藏36 h，添加0.05%的肉桂醛对青稞鲜湿面有较好的改善色泽的效果，与对照组相比样品贮藏36 h使其L*值提高5.29，a*值降低0.41，b*值升高2.435。

3 结 论

在25 ℃、36 h的贮藏条件下，随着抑菌剂添加量的增加其抑菌效果也显著提高。相较于两个对照组，添加0.025%的肉桂醛和Nisin对蜡样芽孢杆菌均有抑制作用，分别使得贮藏终点的青稞鲜湿面中蜡样芽孢杆菌比对照组显著减小0.64（lg（CFU/g））和0.83（lg（CFU/g）），而0.05%肉桂醛和0.05% EGCG分别使得青稞鲜湿面中的蜡样芽孢杆菌菌落数比对照组减小2.49（lg（CFU/g））和2.07（lg（CFU/g））。可见肉桂醛的抑菌活性最好，0.025%和0.05%的添加量都可抑制青稞鲜湿面中蜡样芽孢杆菌的生长，而Nisin的添加量要求限制了其在青稞鲜湿面的保鲜应用。

在25 ℃、36 h的贮藏条件下，低添加量（0.025%）的肉桂醛、EGCG和Nisin对青稞鲜湿面的质构以及色泽均无显著性影响；高添加量（0.05%）的肉桂醛和EGCG仅可在12～24 h贮藏期内提高青稞鲜湿面的硬度以及在贮藏12 h时提高青稞鲜湿面的咀嚼性，但有较好的改善色泽作用。贮藏至36 h，与对照组相比，0.05%肉桂醛和EGCG分别使鲜湿面L*值提高了5.295和2.915，且0.05%肉桂醛使样品的b*值显著增加2.44，使青稞鲜湿面整体颜色更加偏黄色。