普通和冻干三七粉的有效成分及药理作用比较

张君，孙思勉，赵琳，周航，林冬菊，霍小位

(河北大学 药学院，河北省药物质量分析控制重点实验室，河北 保定 071002)

三七(Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen)为五加科植物三七的干燥根，又名田七，主产于中国云南、广西.三七作为广泛应用的中药，其有效成分主要有挥发油、黄酮、氨基酸等，具有止血生肌、活血化瘀、消肿定痛、滋补、强壮、抗衰老、免疫调节等作用[1].虽然三七使用广泛，但三七根茎、三七花的干燥仍以传统方法为主，三七中的皂苷、三七素、氨基酸、挥发油等主要有效成分在高温下易分解，引起活性物质损失从而导致三七的药效下降[2-3].真空冷冻干燥技术可以有效地保存三七等中药的药效成分[4-7].云南省食品药品监管局于2018年发布了三七(冻干)、三七颗粒(冻干)、三七粉(冻干)、三七切片(冻干)4个中药饮片炮制规范，表明真空冷冻干燥技术已经开始应用于炮制三七制剂.

真空冷冻干燥技术, 就是将含水的中药材或西药材料冻结成固态, 调整其温度，在真空条件下冰就会升华成为水蒸气, 从而将药物中的水分清除, 达到理想的效果[8].目前, 冻干技术不仅用于血清、血浆、疫苗、酶、抗生素、激素等药品以及食品的生产, 而且在对性质不稳定的化学药品和中药新剂型研发中的应用也越来越多[9],还可以解决一些药物新剂型长期储存容易发生沉降、絮凝、聚结、变质的问题，提高其稳定性[10], 临床治疗效果良好的不少中药制成冻干粉针后，其成型性、水溶性较注射液好，稳定性大大提高[11]，天花粉、双黄连等中药粉针剂在临床上的普遍应用就是明证[9].实验证明真空冷冻干燥的三七，脱水彻底，干燥后的成品表面黄白色，质轻，药味浓[12].且从内部结构的保持和复水品质角度来看，真空冷冻干燥切片具有较均一的多孔、疏松结构，组织致密，复水时间短，复水比大，复水后口感佳，与新鲜三七差别最小，故真空冷冻干燥法优于自然干燥法和热风干燥法等传统干燥法[12].

通过目前的固有制剂与其他药物冻干粉或冻干制剂的比较来看，冻干粉对提高药物疗效和提升药物的某些治疗优势有明显作用，而且可以从某些方面更好地保证药物有效成分的完整度.本文将以三七为研究对象，通过对三七冻干粉和三七普通粉的有效成分分析及药理作用比较研究，提出三七冻干粉的优势.

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF级昆明种健康小鼠，雄性，70只，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号：SCXK(鲁)20140007.

1.2 药品及试剂

三七普通粉和三七冻干粉(河北祁一堂药业有限公司)；对二甲苯(天津市科密欧化学试剂有限公司)；人参皂苷Rg1标准(批号RG322803，合肥博美生物科技有限责任公司)；人参皂苷Rb1标准品(批号RG202004，合肥博美生物科技有限责任公司)；三七皂苷R1标准品(批号RG 202683，合肥博美生物科技有限责任公司)；乙腈(福晨(天津)化学试剂有限公司)；甲醇(福晨(天津)化学试剂有限公司).

1.3 实验仪器

电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；一次性毛细玻璃管(华西医科大学仪器厂生产)；光学显微镜(制造商：Qimaging)；电子显微镜(德国卡尔蔡司公司)；柱温箱(大连日普利科技仪器有限公司)；示差折光检测器(SHOKO CO.LTD)；高效液相色谱仪(北京钢臣科技有限公司).

2 实验方法

2.1 显微镜观察

2.1.1 光学显微镜观察

将三七普通粉末和三七冻干粉末均匀分散于载玻片上，置于光镜下进行观察，选取合适的放大倍数进行比对观察.

2.1.2 电子显微镜观察

将三七普通粉末和三七冻干粉末，分别借助于棉球直接撒落在载物片上，再用洗耳球轻吹试样，除去附着的微粒，将载有微粒的载玻片翻转，对准试样台，用小镊子轻轻敲打，使颗粒均匀地落在试样台上，喷涂导电膜后，置于电镜下进行观察，选取合适的放大倍数进行比对观察.

2.2 三七普通粉和三七冻干粉的溶解度考察

将三七普通粉和三七冻干粉配置成终质量浓度相同的混悬液(终质量浓度0.01 g/mL). 肉眼观察其溶解度是否有明显区别.

2.3 三七普通粉和冻干粉有效成分含量的测定

2.3.1 混合对照品储备液的配制

精密称取干燥至恒重的人参皂苷Rg1、 Rb1和三七皂苷R1对照品4.1、4.3、1.7 mg置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品储备溶液.

2.3.2 供试品溶液的配制

精密称定三七普通粉、三七冻干粉各0.5 g，置于50 mL的容量瓶中，用甲醇定容，称定质量，放置过夜，并将其超声1 h，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，离心，微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液，即得.

2.3.3 色谱条件

色谱柱：上海月旭UltimateXB-C18 (250 mm×4.6 mm)；柱温25 ℃；检测波长203 nm；体积流量1.0 mL/min；进样量30 μL；流动相为乙腈(A)-水(B)，采用梯度洗脱，0～12 min，A-B (体积比为19∶81)，12～70 min (体积比为36∶64).

2.3.4 标准曲线的测定

混合对照品溶液分别稀释0.75、2、4、6、10倍，在上述色谱条件下进样测定.以进样质量浓度x(μg/mL)为横坐标，峰面积积分值y为纵坐标绘制标准曲线，并进行线性回归，得到3种对照品的线性回归方程.三七皂苷R1在17～170 μg/mL与其峰面积之间呈良好的线性关系，其线性回归方程为y=19 287x-34.752，r=0.999 1;人参皂苷Rg1在41～410 μg/mL与其峰面积之间呈良好的线性关系，其线性回归方程为y=30 228x-114.76，r=0.999 5；人参皂苷Rb1在43～430 μg/mL与其峰面积之间呈良好的线性关系,标准曲线为y=16 005x-48.407，r=0.999 8.

2.4 三七普通粉和三七冻干粉的药理作用比较

2.4.1 动物分组及给药

小鼠按体重随机分为7组，每组10只：空白对照组、普通三七粉高剂量组(2 g/kg)、普通三七粉中剂量组(1 g/kg)、普通三七粉低剂量组(0.5 g/kg)、三七冻干粉高剂量组(2 g/kg)、三七冻干粉中剂量组(1 g/kg)、三七冻干粉低剂量组(0.5 g/kg).按10 g体质量灌胃给药0.2 mL，每天1次，连续给药10 d.每2天称量1次体质量.

2.4.2 毛细玻管法测凝血时间

末次给药30 min后，用毛细玻管插入小鼠眼球静脉丛，自血液流进玻管内计时，待血柱约5 cm时取出毛细玻管，平放于实验桌上，每隔30 s折断毛细玻管两端约0.5 cm，并缓慢向左右拉开，观察断端有无凝血丝，记录从毛细玻管采血至出现凝血丝的时间即为凝血时间.

2.4.3 剪尾法测出血时间

末次给药30 min后，将每只小鼠尾尖剪掉约1 cm，待血液自行溢出时开始计时.每隔30 s用滤纸轻轻吸去血滴，直至滤纸吸时无血为止，即为出血时间.

2.4.4 耳肿胀实验测定抗炎作用

末次给药30 min后，用二甲苯50 μL均匀涂抹每只鼠的右耳，30 min后颈部脱臼处死，分别用打孔器取相同部位左右耳片，分析天平称重，以左右耳片差值为肿胀度，计算肿胀率，肿胀率=(右耳质量-左耳质量)/左耳质量×100%.

2.4.5 不同三七粉对小鼠免疫器官的影响

不同三七粉给药组小鼠颈部脱臼处死后，迅速解剖，摘取小鼠的脾脏和胸腺，称取每个器官的质量，计算器官指数.器官指数=器官质量(mg)/体质量(g).

2.5 统计学分析

3 实验结果

3.1 显微镜观察结果

3.1.1 光学显微镜观察

如图1所示，在光镜下观察，三七普通细粉颗粒大小不均，颗粒聚集明显，形态各异，图1中散布极细粉等现象.与三七普通粉相比，三七冻干粉大小分布较均匀，形态多呈椭圆形，少见聚集.由光镜结果可知，三七冻干粉的颗粒更为分散细腻.

粒径为20 μm；物镜：UPLFLN 40×/0.75.图1 光镜下三七普通粉(a)、三七冻干粉(b)形态特征Fig.1 Morphological characteristics of ordinary P. notoginseng powder(a)lyophilized P. notoginseng powder(b)under light microscope

3.1.2 电子显微镜观察

如图2所示，在电子显微镜下观察，三七普通细粉颗粒大小差异明显，出现颗粒聚集，颗粒边缘较为锋利的特征.而三七冻干粉颗粒大小较为均匀，边缘较为圆润，少见聚集，颗粒更为分散.由此可见，冻干粉粉碎后的颗粒更为细腻均匀.

3.2 溶解度观察

如图3所示，在2种粉末溶液配制终质量浓度相同的情况下，三七普通粉混悬液溶液较为透明，瓶底颗粒沉积现象明显，溶解度较差.而三七冻干粉粉末溶液更为浑浊，呈现明显的混悬状态，表明溶液的分散更为均匀.

粒径为100 μm；普通粉630×；冻干粉860×.图2 电子显微镜下三七普通粉(a) 三七冻干粉(b)的形态特征Fig.2 Morphological characteristics of ordinary P. notoginseng powder (a)lyophilized P. notoginseng powder(b)under electron microscope

图3 三七普通细粉混悬液(a) 三七冻干粉混悬液(b)Fig.3 Suspension of ordinary P. notoginseng powder (a)suspension of lyophilized P. notoginseng powder(b)

3.3 三七粉和冻干粉有效成分的含量测定

经高效液相色谱分析检测，结果见图4. 三七普通粉中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的质量分数分别为11.2、29.0、39.6 mg/g；三七冻干粉中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的质量分数分别为9.6、32.2、34.0 mg/g.

由此可得，三七普通粉的三七皂苷R1和人参皂苷Rb1含量较三七冻干粉各高出14.3%和14.1%，而人参皂苷Rg1的含量则低于三七冻干粉10%.

1.三七皂苷Rl；2.人参皂苷Rgl；3.人参皂苷Rbl.图4 混合对照品(a)、三七普通粉(b)和三七冻干粉(c)的HPLC谱 (n=3)Fig.4 HPLC atlas of mixed reference(a)、ordinary P. notoginseng powder (b)and lyophilized P. notoginseng powder(c)

3.4 三七普通粉和冻干粉对小鼠体质量的影响

如图5所示，给药期间，各组小鼠之间的体质量没有显著性差异，表明各给药组小鼠均没有出现明显的毒性反应.

图5 实验动物体质量变化(n=10)Fig.5 Changes in body mass of experimental animal (n=10)

3.5 三七普通粉和冻干粉对小鼠凝血实验的影响

如表1所示，与空白对照组比较，普通粉高剂量组能够明显缩短凝血时间(P<0.05)，其他给药组没有显著性差异，表明普通粉高剂量组有一定的凝血作用.

表1 普通三七粉与冻干三七粉对小鼠出血时间及凝血时间的影响(mean±SD,n=10)

3.6 三七普通粉和冻干粉对小鼠耳部肿胀实验的影响

如表2所示，冻干粉高剂量组能够明显减轻二甲苯所致小鼠耳肿胀的肿胀度，与空白组比较有显著性差异(P<0.05)，表明冻干粉高剂量组有一定的抗炎作用.该组的肿胀率也较低，但是与空白对照组比较没有显著性差异.

表2 普通三七粉与冻干三七粉对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响(mean±SD,n=10)

3.7 三七普通粉和冻干粉对小鼠免疫器官的影响

如表3所示，各给药组小鼠的胸腺指数、脾脏指数与空白对照组比较没有显著性变化，表明三七普通粉和冻干粉对小鼠的免疫器官均没有显著影响.

表3 普通三七粉与冻干三七粉对小鼠免疫器官指数的影响(mean±SD,n=10)

4 结果与讨论

冷冻干燥技术的干燥效果好，对物质的影响较小，是生物活性物质和许多中药材较理想的干燥方法.冻干能够使物质中的热敏成分，例如蛋白质、微生物和其他生物活性成分得到保护，减少易挥发及易氧化成分的损失，最大限度地保持物质原本的性状.冻干粉加水后溶解迅速而完全.此外，在药材冻干之后进行真空或氮气封口，以隔绝氧气，低温存放，能延长药材的保存时间[13].本实验研究结果显示，三七冻干粉较三七普通粉，颗粒大小更为均匀，边缘更为圆润，少见聚集，颗粒更为分散细腻.溶解度观察结果显示冻干粉溶液的分散更为均匀，进一步明确了三七冻干粉在颗粒均一性及溶解度方面的优势.

现代研究表明普通三七粉干燥过程极易破坏其内含的皂苷和挥发油等活性成分，影响三七的药用价值和疗效，而冻干三七粉能有效地将这些成分保留下来[14].而且冻干三七粉含水量少，同等质量，冻干三七粉的活性成分含量较高. 因此，冻干三七粉给生产生活带来便利的同时将降低三七炮制过程中有效成分的损失[15].在本研究中HPLC的实验结果也显示三七冻干粉与三七普通粉的有效成分含量不同，三七普通粉的三七皂苷R1和人参皂苷Rb1含量较三七冻干粉分别高出14.3%和14.1%，而三七冻干粉中人参皂苷Rg1的含量则高于普通粉10%. 以上结果表明，三七冻干粉与三七普通粉有效成分的含量存在差异，而有效成分含量的差异可能造成其药理活性的差异.目前，对三七冻干粉的药理活性优势的阐述并不清楚.

在本研究中，动物实验结果显示，三七普通粉的抗凝血作用较为明显，而三七冻干粉的抗炎作用明显优于三七普通粉，因此三七普通粉与三七冻干粉的药理活性存在明显差异.据报道，三七总皂苷具有良好的抗凝血效果，三七总皂苷中又以三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1 3种成分的含量最高. 此外，三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1均能够降低炎症因子的表达[16-19]，有明显的抗炎作用. 因此，三七冻干粉与三七普通粉药理活性的差异可能与其有效成分的含量存在差异有关，具体的作用机制仍有待深入研究.

综上所述，三七普通粉与三七冻干粉在颗粒均一性、溶解度、有效成分含量及药理活性方面存在差异.其中，三七冻干粉在颗粒均一性及溶解度方面具有优势，其人参皂苷Rg1的含量较普通粉高，而三七皂苷R1和人参皂苷Rb1含量较三七普通粉低. 此外，三七普通粉有明显的促凝血作用，而三七冻干粉则显示出一定的抗炎活性.本研究首次系统的阐述了三七普通粉和三七冻干粉在有效成分及药理活性方面的差异，将为三七冻干粉和三七普通粉的应用提供一定的科学依据.