不同贮藏处理对‘槜李’果实采后生理特性的影响

贾展慧，宣继萍，王 刚，张计育，王 涛，郭忠仁

（中国科学院植物研究所，南京 210014）

‘槜李’（Prunus salicina L.‘Zuili’）又名‘醉李’，是蔷薇科（Rosaceae）李属（Prunus）植物，距今已有2 500多年的栽培历史，主要分布于浙江嘉兴地区，是我国稀有的李中珍品。‘槜李’具有极佳的风味品质，软熟后肉质化浆，汁液香如醴、甘如蜜。这一特性赋予其独特的商品特性。果实成熟季节在7月，气温较高，采后迅速进入呼吸高峰期，并在3 d 内迅速软化，达到后熟化浆状态，极不耐贮藏。采收后的李果实生理活动旺盛，在运输销售及贮藏过程中果实腐烂严重，成为制约‘槜李’果实市场流通的主要因素。

‘槜李’属于呼吸跃变型果实，成熟时常伴随大量乙烯产生，贮藏期间易受内源或外源乙烯作用而软化，果实品质迅速降低。因此，乙烯在果实软化进程中起着重要作用。1984年，Yang 等[1]首次提出植物体内乙烯生物合成途径：蛋氨酸（ Methionine，Met）首先在三磷酸腺苷（Triphosadenine，ATP）参与下，转变为S-腺苷蛋氨酸（S-adenosyl methionine，SAM），SAM在ACC合成酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACS) 催化下被转化为1-氨基环丙烷1-羧酸（1-Aminocylopropane-1-carboxylic acid，ACC），ACC 在ACC 氧化酶 (1 -aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase，ACO）作用下生成乙烯，即Met→SAM→ACC→乙烯。其中催化途径发生的关键酶是ACS 和ACO。

在果实采后生理研究中，贮藏的处理方式很多，其中应用低温以及生理调节物质处理是改变果实衰老进程常用的技术手段。低温贮藏措施通过降低酶的活性、下调表达基因等降低果实的代谢速率，延缓果实成熟软化； 而生理调节物质不仅包括一氧化氮（Nitric Oxide，NO）[2]（Hao et al.，2016）、1-甲基环丙烯（1-Methylcyclopropene，1-MCP）[3]（Lin et al.，2018）、水杨酸（Salicylic Acid，SA）[4]（Martínez-Esplá，2018）和钙离子（Calcium Ion，Ca2+）[5]（Liu et al.，2017）等乙烯拮抗剂，还包括外源乙烯和乙烯利等乙烯促进剂。Ca2+能抑制果实呼吸、乙烯释放，达到延缓果实衰老的作用；而乙烯利是外源乙烯替代物，其作用效果与处理浓度、果实成熟度和贮藏条件有关。低浓度的外源乙烯处理刺激内源乙烯的合成，加速果实成熟衰老；高浓度的内源乙烯处理可能对果实内源乙烯的合成产生反馈调节，抑制内源乙烯的合成[6]。

目前，国内外学者关于不同温度，以及不同处理对果实采后生理影响的研究在苹果、梨、桃和猕猴桃等果品方面的报道较多，但对李果实生理特性影响及乙烯合成关键酶的系统研究尚少。本试验以‘槜李’采后果实为材料，研究不同温度贮藏以及外源乙烯、减压浸钙处理中果实生理特性及乙烯生物合成关键酶的变化，探究乙烯合成途径关键酶在乙烯生成过程中起到的作用及外源乙烯和钙对乙烯生物合成途径的调控。

1 材料与方法

1.1 植物材料

‘槜李’果实采自浙江省桐乡市桃园村‘槜李’种质资源苗圃。于2017年6月25日采收八成熟果实，立即运回江苏省中国科学院植物研究所（南京）果树科学试验室进行分析，筛选成熟度一致、大小均一、无病虫、无机械损伤的果实随机分成4 组，分别进行不同采后处理，每个处理250 个果实。采后当天开始测定相关指标，记为0 d。果实品质和酶活性每2 d 测定1 次，共测定6 次。乙烯释放速率每天测定1 次，共测定11 次。每2 d 每个处理取20 个果实的果肉组织，去除外果皮和内果皮，把果实的中果皮在液氮中速冻后，-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2 处理方法

常温处理 将果实贮藏于相对湿度（Relative Humidity，RH）为85%～90%、温度为（25±1）℃的环境中，做为整个试验的对照组（Control Check，CK）。

低温处理 将果实贮藏于RH 为85%～90%，温度为（4±1）℃的环境中。

外源乙烯处理 将果实浸泡在0.5 μl·L-1乙烯利溶液中（超纯水配制），1 min 后捞出晾干，贮藏环境RH为85%～90%、温度为（25±1）℃。

减压浸钙处理 将果实浸泡在2%CaCl2溶液中(超纯水配制)，在80 kPa 压力下浸泡5 min 后捞出晾干，贮藏环境RH 为85%～90%、温度为（25±1）℃。

1.3 测定项目与方法

硬度 利用3.5 mm 直径探头的GYB-1 型（上海）果实硬度计检测果实硬度。各处理随机抽取5 个果实，去掉果实缝合线两侧最大横径处的外果皮，在该区域测量硬度值，记为kg·cm-2。每天测定1 次单果重，重复4 次。

乙烯释放量 将各处理‘槜李’果实分别置于密闭容器中1 h 后，抽取容器顶层气体1 mL，采用Agilent 6820 型（北京京科瑞达科技有限公司）气相色谱仪测定乙烯释放量，Al2O3柱，柱温40 ℃，检测器（FID）温度为210 ℃，载气为N2，流速0.6 mL·min-1，气化室温度为160 ℃。每处理取5 个果实，每天测定1 次，取3 次气样，取平均值。

ACS 活性 测定方法参照Khan and Singh[7]的方法，并略作改动，具体操作如下。

取6个果实随机称取10 g果肉组织，迅速转移至含5 mL磷酸钾缓冲液（0.5 M，pH值8.5）[0.5 M磷酸钾、5 μM磷酸吡哆醛、5 mM硫苏糖醇、3%（v/v）PVP]的研钵中,放入适量石英砂，冰上研磨成匀浆。4 ℃，8 000 g·min-1，离心20 min，取上清液。取5 mL短螺纹口样品瓶，分别依次加入2 mL 上清液，1 mL 蛋氨酸（500 μM）溶液。旋上带有橡胶隔膜的螺旋盖密封，检查气密性。30 ℃水浴30min 后迅速转移至冰上冷却，用一次性医用针管依次加入0.1 mL HgCl2（50 mM）和0.3 mL 的5%NaOCI：饱和NaOH=2∶1（v/v）的混合液，涡旋5s。在冰上静置2.5min。用气密微量进样器抽取l mL 气体，立即用气相色潜仪测定乙烯含量，试验重复3 次。气相色谱条件同上。

ACO 活性 测定方法参照Khan and Singh[7]的方法，并略作改动，具体操作如下。

取6 个果实随机称取2 g 果肉组织，迅速转移至含有5 mL 提取缓冲液 [0.1 M Tris-HCl、pH 值7.2、10%（w/v）甘油、30mM 抗坏血酸钠、3%（v/v）PVP]的研钵中，放入适量石英砂，冰上研磨成匀浆。4 ℃，8 000 g·min-1，离心20 min，取上清液，所有步骤均在冰上进行。取5 mL 短螺纹口样品瓶，分别依次加入1.8 mL 上清液，0.1 mL ACC（40 mM）和0.1 mL FeSO4（1 mM）。旋上带有橡胶隔膜的螺旋盖密封，检查气密性。30 ℃水浴60 min后迅速转移至冰上冷却，用气密微量进样器抽取l mL气体，立即用气相色潜仪测定乙烯含量，试验重复3次。气相色谱条件同上。

1.4 数据分析

果实硬度、乙烯释放量、ACS 活性和ACO 活性测得的数据用Excel2013（Microsoft，American）进行数据整理，并用OriginPro 8.5 进行单因素方差分析，以P 值表示检验的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 果实硬度

从图1可知，随着贮藏时间的延长，4 个处理组的果实硬度均呈下降趋势，与贮藏时间呈极显著线性负相关关系（P＜0.01）。采后贮藏2 d，对照组果实硬度从1.27 kg·cm-2下降到0.59 kg·cm-2，降幅为53.5%；Ca2+处理组和低温处理组果实硬度的降幅分别为51.2%和36.2%； 而经外源乙烯处理的果实硬度降幅达100%，即果实完全软化，硬度为0 kg·cm-2。采后贮藏3 d，对照组果实完全软化，硬度为0 kg·cm-2；Ca2+处理组和低温处理组果实硬度分别为0.57 kg·cm-2和0.61 kg·cm-2。方差分析可以看出，Ca2+处理组、低温处理组和对照组之间果实硬度差异达极显著水平（P＜0.01）。经Ca2+处理的果实在采后贮藏4 d硬度为0 kg·cm-2，果肉软化，比对照组推迟1 d； 而低温贮藏的果实在采后5 d 硬度为0 kg·cm-2，果肉软化，比对照组推迟2 d；说明Ca2+和低温能有效延缓‘槜李’果实软化。

2.2 乙烯释放量

乙烯在果实成熟软化中起着重要的作用。从图2可知，4 个处理的‘槜李’采后内源乙烯释放量均呈现典型的跃变高峰，但高峰出现的时间有所差异：对照组‘槜李’的乙烯释放高峰出现在采后贮藏3 d，峰值为1.66 μl·g-1·h-1； 外源乙烯处理组释放高峰同样出现在采后3 d，峰值为2.07 μl·g-1·h-1，是对照的1.2 倍，二者差异显著（P＜0.05），且内源乙烯释放量在整个贮藏期间均高于对照组； Ca2+处理组高峰出现在采后4 d，较对照组推迟1 d，但峰值为2.54 μl·g-1·h-1，是对照峰值的1.5 倍，二者差异极显著（P＜0.01），且内源乙烯释放量在整个贮藏期均高于其他3 个处理组； 低温处理组高峰则出现在采后5 d，比对照组推迟2 d，峰值为1.45 μl·g-1·h-1，且其内源乙烯释放量普遍低于对照组。‘槜李’果实采后软化过程中乙烯生成具有明显的跃变高峰，但是贮藏过程中乙烯释放高峰晚于硬度快速下降期，说明果实乙烯跃变只是果实成熟的结果，而非果实软化的启动因子。

2.3 果实ACS 活性

ACS 是高等植物乙烯生物合成过程中的限速酶，它在植物组织中的活性大小往往决定着乙烯的产生速率。从图3看出，4 个处理组的ACS 活性在采后整个贮藏时期都能被检测到，表现出明显的先升后降趋势。对照组ACS 活性在采后贮藏3 d 达到高峰，峰值为183.15 μg-1·h-1·C2H4；外源乙烯处理组在整个贮藏时期ACS 活性最高，在采后3d 达到峰值300.57μg-1·h-1·C2H4，是对照的1.6 倍，二者差异极显著；Ca2+处理组ACS 活性在整个贮藏期间比对照组低，在采后4 d 达到峰值158.56 μg-1·h-1·C2H4，较对照推迟1 d，Ca2+对ACS 活性有抑制作用； 低温处理组在整个贮藏时期ACS 活性最低，在采后5 d 达到峰值146.30 μg-1·h-1·C2H4，较对照推迟2 d，低温明显抑制了ACS 的活性。ACS 活性在槜李果实软化过程中的增加亦伴随着乙烯释放量的增加，且它们均于同一软化度达峰值。

2.4 果实ACO 活性

ACO 是乙烯生物合成过程中的关键酶。从图4可知，4 个处理组的ACO 活性在采后整个贮藏时期都能被检测到，并随着贮藏时期的增加表现出明显的上升趋势。对照和外源乙烯处理组ACO 活性上升趋势平缓，且外源乙烯处理组ACO 活性在整个贮藏时期均比对照组低；Ca2+和低温处理组ACO 活性上升趋势明显，采后贮藏9 d，Ca2+处理组ACO 活性为229.18 μg-1·h-1·C2H4，是同天对照（76.21μg-1·h-1·C2H4）的3 倍，是同组采收当天（17.32μg-1·h-1·C2H4）的13.2 倍，差异极显著（P＜0.01）；而低温处理组采后9 d ACO 活性为298.10 μg-1·h-1·C2H4，是同天对照（76.21μg-1·h-1·C2H4）的4 倍，是同组采收当天（11.03μg-1·h-1·C2H4）的27 倍，差异极显著（P＜0.01）。

3 讨论与结论

‘槜李’属于呼吸跃变型果实，采收期正值高温季节，采后果实生理代谢旺盛，软化迅速，成熟衰老进程很快。本试验结果显示，‘槜李’成熟软化过程中，采后贮藏2 d 为果实硬度快速下降阶段（图1），果实硬度明显下降，果肉细胞壁微纤丝松散，肉质化浆，是典型的水蜜李型；与齐玉洁[8]研究的一致，乙烯释放量呈现明显的跃变高峰，高峰出现在硬度快速下降期之后。认为在‘槜李’采后贮藏时期，乙烯跃变是软化的结果之一。果实成熟期可能还存在其他启动软化的相关因子。

Yang 等[9]在研究番茄、甜瓜、苹果和香蕉完熟时发现，ACS 和ACO 的活性都增加。Oeller 等[10]发现携带反义ACS 的转基因番茄乙烯生物合成严重受阻，果实能够维持一定硬度不软化。本试验结果与前人研究成果一致，伴随着‘槜李’果实硬度下降，ACS 的活性随着乙烯释放量的增加而增强，且于同一成熟度达峰值（图2、图3）。说明ACS 不但与乙烯合成密切相关，而且在果实成熟软化过程中起着一定的作用。Tatsuki 等[11]研究发现，不能合成乙烯的突变品种‘Stony hard’桃在采后成熟时不软化，且乙烯生成量非常低，PpACS1 不表达；而PpACO1 有较高表达量，且PpACO1 在‘Yumyeong’桃表达比软化迅速的‘Akatsuki’桃高，与本试验结果一致；低温贮藏延缓了‘槜李’果实的软化，抑制乙烯释放，ACS 活性小，而ACO 活性最大；外源乙烯加速了果实的软化，促进乙烯释放，ACS 活性高，而ACO 活性最小。说明ACS 为乙烯合成的主效酶。经Ca2+和低温处理的果实采后软化延迟，可能是由于ACS 基因转录受阻，ACS 活性受抑制，因而乙烯释放量低，进而抑制后续一系列与软化相关的生理反应，造成ACO 转录产物的积累。

乙烯能促进果实成熟。利用采后乙烯处理调控果实成熟一直以来被广泛报道。‘Stony hard’桃的果肉即便在成熟过程中也不会软化，但是通过0.1～100.0 μl·L-1外源乙烯处理，该突变体硬度迅速下降，从而恢复果实软化[11]。本试验中，‘槜李’果实经0.5 μl·L-1外源乙烯处理，果实硬度迅速下降，乙烯跃变提前，乙烯释放量增大，ACS 活性增强，促进果实迅速软化。说明乙烯在促进果实软化中起了关键作用。

果实硬度与果实中的钙水平呈正相关，较高的钙水平能增加果实硬度。普遍认为Ca2+与细胞壁中果胶结合形成交叉链桥，减少了细胞壁的透性，从而降低了果实内酶与底物的接触，能有效地减缓果实的软化速度，保持较高的果实硬度[12]。邓佳等[13]用2% CaCl2溶液浸泡葡萄柚果实，发现细胞壁降解酶基因表达水平下降，细胞壁降解酶活性降低，果胶、半纤维素的解聚变缓，从而达到维持果实质地品质、延长果实货架期寿命的目的。Liu[5]等将杏浸泡在1%和3%钙溶液中，发现杏细胞壁多糖链的基本宽度变小，显著提高了杏的保质期；苹果在贮藏期间用氨基酸钙溶液浸泡处理后，果实硬度和可溶性固形物含量增加，果实乙烯释放量降低，耐贮性提高[14]。本试验用2% CaCl2溶液浸泡‘槜李’果实表明，Ca2+处理明显保持了果实硬度（图1），降低了乙烯释放速率（图2）；而经Ca2+处理的‘槜李’果实乙烯释放量增加，与前人研究认为Ca2+能抑制乙烯释放的结果相悖，原因有待进一步的研究。

低温明显抑制了‘槜李’果实硬度的下降（图1），保持着果实良好的品质； 一定条件的低温贮藏对乙烯释放速率及其相关酶活的控制效果极为显著（图2、图3）。主要是由于低温抑制了启动或调解乙烯生物合成和信号转导，以及与成熟相关酶的活性。

果实的成熟软化是一个非常复杂的生理过程，由许多因素相互协同完成，不同的因子在不同时期起不同的作用[15]。‘槜李’果实成熟过程中生理特性的改变及乙烯生物合成相关因子的变化与槜李果实成熟软化的关系还有待于进一步研究。