一株嗜盐反硝化弧菌的耐盐能力和降解能力研究

孙文妮， 田凤蓉， 王开春， 徐军， 王强， 张璐璐

（中蓝连海设计研究院有限公司， 江苏 连云港 222004）

生物法被广泛地用于高盐度废水的处理中［1］。但是， 由于高盐环境下的盐析作用， 普通微生物的脱氢酶活性会降低， 高渗透压易使微生物细胞脱水引起细胞原生质分离， 从而导致微生物细胞破裂死亡［2］。 基于上述现象， 工程技术人员提出了利用嗜盐耐盐菌， 采用物化－生化耦合工艺技术处理高盐废 水 的 建 议［3－5］。 该 技 术 的 关 键 是 获 取 耐 盐 能 力、污染物降解能力、 抗盐度冲击能力等综合性能较好的嗜盐菌， 现有技术关于嗜盐菌株尤其是同时具有反硝化脱氮能力的菌株报道较少， 特别是耐盐度超过10%以上的菌株。

本研究的嗜盐菌株YL5－2 是从高盐环境样品中筛选分离得到弧菌属菌种， 通过对菌株的生长条件、 耐盐能力和降解能力的研究表明： 该菌株能够耐受超高盐度， 耐盐范围广， 利用该菌株在高盐度条件下进行反硝化脱氮取得了良好的效果， 特别是在10% 以上盐度条件下反硝化脱氮效果显著， 为该菌株在高盐含氮废水的直接生化处理方面提供了技术支撑和工程化应用依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

YL5－2 菌株是从青海格尔木察尔汗盐湖的环境样品， 经20% 左右盐度分离筛选出来， 鉴定为嗜盐弧菌属菌种。 经生理生化鉴定该菌株属于兼性厌氧菌， 在好氧条件下可利用乙酸生长， 在厌氧条件下利用硝酸盐生长， 为一株嗜盐反硝化菌， 该嗜盐菌株可利用乙酸、 丙酸和溴代琥珀酸为唯一碳源。

1.2 试验试剂

葡萄糖、 乙酸钠、 柠檬酸三钠、 甘油、 甲醇、甲胺、 乙酸、 丙酸、 磷酸氢二钾、 磷酸二氢钾、 硫酸 铵、 氯 化 铵、 硝 酸 钾、 MgSO4、 CaCl2、 NaCl、Na2HPO4、 NaH2PO4、 Na2CO3、 NaHCO3， 以 上 试 剂均为分析纯。

生化试剂为酵母粉、 蛋白胨、 牛肉膏、 琼脂粉。 纯度为96%的溴代琥珀酸。

1.3 培养基

（1） 菌株耐盐试验培养基。 培养基成分为甘油50 mg／L， 葡萄糖25 mg／L， 甲醇50 mg／L， 甲胺20 mg／L， 乙酸钠25 mg／L， 柠檬酸三钠25 mg／L，酵母粉10 mg／L， 蛋白胨20 mg／L， 牛肉膏20 mg／L， NaCl 0 ～340 g／L， 固体培养基再添加琼脂20 g／L。 pH 值为7.5。

（2） 菌株生长温度试验培养基。 培养基成分为甘油500 mg／L， 葡萄糖250 mg／L， 甲醇500 mg／L， 甲胺200 mg／L， NaCl 150 g／L， 乙酸钠250 mg／L， 柠檬酸三钠250 mg／L， 酵母粉100 mg／L， 蛋白胨200 mg／L， 牛肉膏200 mg／L， 微量元素少量。pH 值为7.5。

（3） 菌株生长pH 值试验培养基。 培养基成分为 甘 油500 mg／L， 葡 萄 糖250 mg／L， 甲 醇500 mg／L， 甲胺200 mg／L， NaCl 150 g／L， 乙酸钠250 mg／L， 柠檬酸三钠250 mg／L， 酵母粉100 mg／L，蛋白胨200 mg／L， 牛肉膏200 mg／L， 微量元素少量。 以Na2HPO4／NaH2PO4（pH 值 为5.0 ～7.0）、Na2CO3／NaHCO3（pH 值为8.0 ～12.0）为缓冲液调节设定培养基pH 值。

（4） 菌株有机酸降解培养基。 乙酸降解培养基： 乙酸2 000 mg／L， 磷酸二氢钾、 MgSO4、 CaCl2各100 mg／L， 氯化铵、 尿素各250 mg／L， NaCl 质量分数3%～30%。 缓冲液调节pH 值至7.5 ～8.0。

丙酸降解培养基： 丙酸2 000 mg／L， 磷酸二氢钾、 MgSO4、 CaCl2各100 mg／L， 氯化铵、 尿素各250 mg／L， NaCl 质量分数3%～30%。 缓冲液调节pH 值至7.5 ～8.0。

溴代琥珀酸降解培养基： 溴代琥珀酸2 000 mg／L， 磷酸二氢钾、 MgSO4、 CaCl2各100 mg／L，氯化铵、 尿素各250 mg／L， NaCl 质量分数3% ～30%。 缓冲液调节pH 值至7.5 ～8.0。

（5） 菌株反硝化脱氮培养基。 培养基成分为乙酸2 000 mg／L、 蛋白胨20 mg／L、 牛肉膏20 mg／L，NO3-－N 100 mg／L， NaCl 质量分数3%～30%。 缓冲液调节pH 值至7.5 ～8.0。

1.4 仪器设备

生物安全柜、 超净工作台、 荧光显微镜、 电子天平、 高压蒸汽灭菌器、 隔水式恒温培养箱、 生化培养箱、 恒温摇床、 干燥箱、 手持式pH 计、 GE总有机碳分析仪、 UV754N 紫外分光光度计、 气相分子吸收光谱仪等。

1.5 试验方法

（1） 菌株YL5－2 耐盐能力试验。 将活化的新鲜菌苔划线于不同盐度（0 ～34% 饱和盐度）的耐盐试验固体平板培养基上， 封口膜封口防止培养基水分流失增加盐度， 于35 ～37 ℃培养， 考察各盐度下培养基能否长出新的菌苔及生长速度， 评价菌株YL5－2 的耐盐能力。

（2） 菌株YL5－2 适宜生长温度范围。 根据菌株耐盐试验情况， 在最适生长盐度， pH 值为7.2左右的条件下， 比较不同温度下（4 ～50 ℃）菌体的生长量， 以OD600值来间接衡量， 绘制生长曲线，根据生长趋势， 判定菌株适宜生长温度。

（3） 菌株YL5－2 适宜生长pH 范围。 在菌株最适温度和最适盐度条件下， 比较不同pH 值（5 ～11）下菌体生长量， 以OD600值来间接衡量， 绘制生长曲线， 根据生长趋势， 判定菌株适宜生长pH 范围。

（4） 菌株YL5－2 的降解能力。 有机酸降解试验： 设置3%～30%盐度梯度， 将活化的菌株分别转接到乙酸、 丙酸和溴代琥珀酸初始质量浓度为2 000 mg／L、 初始pH 值为7.5 ～8.0 的降解培养基中， 在35 ℃、 160 r／min 条件下摇床培养72 h， 每24 h 取样测TOC， 通过考察TOC 去除情况反映有机酸降解效果。

反硝化脱氮试验： 设置3%～30% 盐度梯度，将活化的菌株分别转接到NO3-－N 初始质量浓度为100 mg／L、 碳源充足、 初始pH 值为7.5 ～8.0 的反硝化脱氮培养基中， 在35 ℃、 60 r／min 条件下摇床培养72 h， 每24 h 取样测定出水NO3-－N、 NO2-－N和TOC 浓度， 同时关注pH 值变化， 及时调节pH 值在初始浓度范围内。 考察菌株的反硝化脱氮能力。

1.6 分析方法

COD 采用硝酸银沉淀氯离子重铬酸钾氧化法（GB／T 11914—89）， TOC 采用燃烧氧化－非分散红外吸收法（HJ 501—2009）， pH 值采用便携式pH 计法，NO2-－N 采用气相分子吸收光谱法（HJ／T197—2005），NO3-－N 采用气相分子吸收光谱法（HJ／T 198—2005），总盐采用全盐量的测定 重量法（HJ／T 51－1999）， Cl－采用氯化物的测定 硝酸银滴定法（GB／T 11896—1989）， OD600采用紫外分光光度计法。

2 结果与讨论

2.1 菌株耐盐能力

根据菌株的筛选过程中的培养基盐度（20% 盐度）初步判定该菌为中度以上嗜盐耐盐菌， 为考察菌株嗜盐耐盐范围， 试验设定0 ～34% 饱和盐度的广泛盐度范围， 进一步考察菌株在高盐废水中的应用潜力， 结果如表1 所示。

表1 菌株在不同盐浓度培养基上的生长情况Tab. 1 Growth of strains on mediums with different salinities

培养基配制过程中， 34%盐度已经饱和， 但是，试验过程中发现32%盐度的培养基冷却后有少量盐晶体析出， 接种划线时， 沿着划线轨迹出现盐晶体， 说明32%盐度已经达到NaCl 的饱和盐度。

由表1 可知， 在0 ～2% 盐度培养基中无菌苔长出， 在3%～30% 盐度培养基中3 d 内可以明显观察到新长出的菌苔， 在8% ～28% 盐度培养基中， 2 d 内就可以明显观察到新长出菌苔， 在32%饱和盐度培养基中生长7 d 以上才能长出肉眼可见菌苔。 从试验结果可以看出， YL5－2 菌株耐盐范围为3%～32% 饱和盐度， 适宜生长盐度为3% ～30%， 最适生长盐度为8%～28%， 为一株极端嗜盐菌［6］。 利用该类型的嗜盐微生物修复污染的天然盐环境或者处理高盐度污染废水， 具有重要的理论研究价值和广阔的应用前景［7］。

2.2 菌株YL5－2 适宜生长温度

根据菌株耐盐能力， 选择菌株生长状况良好的15% 盐度作为温度试验的盐度指标， 在pH 值为7.2 左右条件下， 通过测定不同温度下菌株YL5－2菌液的OD600值， 反映菌体的浓度以及它的生长情况， 菌液OD600值越大则表明菌体的浓度越高、 生长状况越好。 试验结果如图1 所示。

图1 不同培养温度下菌体生长曲线Fig.1 Growth curves of strains under different culture temperatures

由图1 可知， 在15 ～45 ℃温度范围生长趋势明显； 4 ～10 ℃菌体浓度几乎没有增长趋势， 说明温度低于一定值时， 细胞膜呈现凝胶状态， 营养物质的跨膜运输受阻［8］， 影响了细胞的生长繁殖； 30 ～35 ℃时， 菌体浓度增长迅速， 12 h 基本达到对数生长期， 相比其他温度下长势更加明显。 综合以上分析， 认为YL5－2 菌种适宜的生长温度范围为15 ～45 ℃， 最适生长温度范围为30 ～35 ℃。

2.3 菌株YL5－2 适宜生长pH 值

在15% 盐度， 温度为35 ℃条件下， 设定pH值为5.0 ～11.0， 考察菌株适宜的pH 范围， 为其批量扩增和应用提供参考， 试验结果如图2 所示。

图2 不同pH 值条件下菌体生长曲线Fig. 2 Growth curves of strains under different pH conditions

由图2 可知， 菌株YL5－2 在pH 值为5.0 ～6.0范围， 菌体浓度几乎不增长； 在pH 值为6.5 ～11.0的范围均有一定的生长趋势； 在pH 值为7.5 ～8.0范围， 菌体浓度增长迅速， 相比其他pH 值范围，菌体浓度长势更加明显。 环境pH 值的变化可引起细胞膜电荷和膜通透性的变化， 从而影响微生物对营养物质的吸收， 影响代谢过程中酶的活性［9］， 改变微生物的形态， 甚至可导致微生物生长受到抑制甚 至 死 亡。 Shen 等［8］研 究 表 明 在 厌 氧 或 好 氧 的 膜生物反应器中， 能去除99.9% 以上的硝酸盐且没有亚硝酸盐积累的最佳pH 值范围是7.5 ～8.5。 pH值过高或过低均会抑制反硝化作用， 且反应的最终产物往往是NO2-－N 或N2O［10］。 由于反硝化产碱［11］，因此筛选出的菌株若能适应较广泛pH 值， 那么其应用范围会更加广阔。

综合以上分析， 菌株YL5－2 适宜生长的pH 值范围为6.5 ～11， 最适生长pH 值范围为7.5 ～8.0，表明该菌株能适应较广泛的pH 值范围， 在工程应用上有一定的优势。

2.4 嗜盐菌株YL5－2 对有机酸的降解

对菌株YL5－2 进行有机酸降解试验， 以乙酸、丙酸、 溴代琥珀酸3 种可被菌株用作唯一碳源的有机酸为降解底物进行试验， 设置NaCl 盐度梯度为3%、 5%、 8%、 10%、 12%、 15%、 18%、 20%、25%、 30% 等10 个菌株适宜生长盐度条件， 在最适温度35 ℃， 最适宜pH 值为7.5 ～8.0 条件下，通过72 h 培养， 检测培养液TOC 浓度变化， 反映菌株对乙酸、 丙酸、 溴代琥珀酸3 种有机酸的降解能力， 结果如图3 以及表2 所示。

图3 不同盐度下菌株对乙酸、 丙酸、 溴代琥珀酸的降解曲线Fig. 3 Degradation curves of acetic acid, propionic acid bromosuccinic acid by strains under different salinity conditions

表2 72 h 内在盐度下菌株对3 种有机酸的去除率Tab. 2 Removal rates of three kinds of organic acid by strains in 72 h under different salinity conditions

由图3 以及表2 可知， 在盐度为10% ～25%范围内， 菌株对乙酸的降解速率和去除率最高， 其中15% 盐度为最适盐度， 72 h 对乙酸TOC 的去除率高达96% 以上； 在盐度为10%～25% 范围内菌株对丙酸的降解速率和去除率最高， 其中12% 盐度为最适盐度， 菌株在72 h 对丙酸TOC 的去除率高达94% 以上； 在盐度为10%～20% 范围内， 菌株对溴代琥珀酸的降解速率和去除率最高， 其中12% 盐度为最适盐度， 72 h 对溴代琥珀酸TOC 的去除率达87%以上。

综上得出， 菌株最适降解的有机酸碳源为乙酸， 最适NaCl 盐度为15%， 乙酸去除率高达96%以上。 即使在30%的接近饱和盐度条件下， 对乙酸的去除率仍可以达到79%， 也说明菌株在高盐环境下表现出了极强的抗盐度冲击的能力。

表3 72 h NO3--N 去除情况以及NO2--N 富集情况Tab. 3 NO3--N removal and NO2--N enrichment in 72 h

2.5 嗜盐菌YL5－2 反硝化脱氮能力

以乙酸为碳源， 在盐度分别为3%、 5%、 8%、10%、 12%、 15%、 18%、 20%、 25%、 30% 的条件下培养72 h， 每24 h 取样测定培养液NO3-－N、NO2-－N 浓度， 按照各时间点减少的NO3-－N 浓度与总投加NO3-－N 浓度的比值， 计算NO3-－N 转化率；按照各时间点NO2-－N 富集浓度与总投加NO3-－N浓度的比值计算NO2-－N 的富集率。 试验结果如表3 所示。

由表3 可知， 菌株在盐度为3%～8%和25%～30%条件下都有一定反硝化作用， 但存在NO2-－N累积， 反应不彻底； 在10% ～20% 盐度范围内，对NO3-－N 去除率达95% 以上， 且NO2-－N 富集率低甚至零富集。 结合该嗜盐菌株的耐盐能力试验可知， 该菌株脱氮能力与它最适的生长盐度环境有密切关系， 菌株在其最适生长的盐度下， 脱氮效果也最佳。 这与王伟伟［12］研究的嗜盐菌的嗜盐机理相类似， 嗜盐菌中嗜盐酶要在一定盐浓度下才能保证酶活性及稳定性。

由试验结果可知， 该嗜盐菌株反硝化脱氮最佳NaCl 盐度范围为10%～20%， 这与一般情况下反硝化菌的耐盐能力不同。 一般研究表明， 在盐度不超过2% 的条件下， 反硝化系统可以保持良好的脱氮性能， 反硝化菌更具竞争优势， 但是， 在更高盐度条件下， 往往反硝化速率会出现大幅下降， 甚至产生细胞层面的不可逆的影响［13－14］。 Wang 等［15］对反硝化颗粒污泥进行耐盐能力的考察， 结果表明NaCl和Na2SO4这2 种无机盐对微生物的半抑制质量浓度分别为11.46 和21.72 g／L， 半致死质量浓度分别为77.35 和100.58 g／L。 也有一些通过筛选嗜盐反硝化菌进行高盐脱氮的研究， 如郭艳丽等［16］筛选的菌株YL－1 能在盐度为0 ～10%的培养液中生长， 有很好的反硝化效果； 焦点等［17］分离筛选得到的反硝化菌株DN2， 适合NaCl 盐度为3%～10%环境的反硝化。 但是超过10%盐度的反硝化脱氮鲜有报道。

同时， 试验过程中观察到， 在8%～25% 盐度试验组液面均明显可见气泡产生， 同时伴有少量絮凝菌体上浮， 说明该盐度范围明显有N2生成， 反硝化作用效果良好， 这与刘超等［18］分析的反硝化反应产生N2导致污泥上浮现象一致。 在15% 盐度时， 试验组菌体絮凝性较好， 培养液澄清， 说明该菌株在一定盐度条件下絮凝性能良好， 具有进一步研究的工程化应用潜力。

3 结论

（1） 通过耐盐能力试验， 得出菌株YL5－2 为一株极端嗜盐菌。

（2） 嗜盐菌YL5－2 的耐盐能力极强， 最适生长NaCl 盐度范围为8%～28%， 最适生长温度范围为30 ～35 ℃， 最适生长pH 值范围为7.5 ～8.0。

（3） 嗜盐菌YL5－2 可降解乙酸、 丙酸、 溴代琥珀酸3 种有机酸， 其中乙酸为该嗜盐菌株的最适碳源， 在NaCl 盐度为10%～25% 范围内， 对乙酸去除率可达96%以上。

（4） 嗜盐菌YL5－2 在35 ℃、 pH 值为7.5 ～8.0的厌氧环境下， 在NaCl 盐度为3%～30%范围内对NO3-－N 进行反硝化脱氮， 最适盐度范围为10%～20%， 72 h 对质量浓度为100 mg／L 的NO3-－N 去除率达95%以上， 且NO2-－N 富集率低， 甚至零富集。

（5） 嗜盐菌株YL5－2 具有广泛的耐盐范围，良好的有机酸降解能力和对NO3-－N、 NO2-－N 的反硝化脱氮能力， 在高盐废水特别盐度高于10% 的废水脱氮处理方面， 有着良好的应用潜力， 有望在腌制品、 海产品加工废水， 高盐硝酸盐、 亚硝酸盐化工废水的反渗透浓水以及高盐高有机酸型废水的生化处理方面得到应用。