正交实验法优化土壤碱解氮最佳测定方法

戴 域，李守权，罗 浩

(贵州省地质矿产中心实验室，贵州 贵阳 550018)

土壤碱解氮常作为土壤氮素有效性的指标，能够确切反映近期内土壤的供氮水平[1]。精确衡量土壤的供氮能力，进行有效施肥，不但确保了农业的增产增收，对我国的农业生产发展和控制土壤污染具有重要而深远的意义。

目前，土壤碱解氮一般通过碱解扩散法测定，此法所采用的扩散皿在测定过程中极易引起交叉污染，易导致结果偏差[2]。对此，通过单次单因子法结合全自动定氮仪测定土壤碱解氮被广泛应用[3]，但单次单因子法只能讨论单因素影响，无法考察各因素间的交互作用，难以得到精准的测定结果。因此，优化筛选土壤碱解氮最佳测定条件尤为重要。

正交实验设计通过挑选具备了“均匀分散，齐整可比”的代表性点进行全面实验，此法相较于单次单因子法，可分析多因素间存在的交互作用，是一种高效、快速、经济的实验设计方法[4]。利用正交实验结合定氮仪优化土壤碱解氮测定的最佳条件研究尚未见报道。为了精确测定土壤碱解氮，本研究通过参考LY/T 1228-2015(4)森林土壤氮的测定，初步确定正交实验影响碱解氮含量的称样量、NaOH溶液和蒸馏时间等因素和水平选择，最终筛选测定土壤碱解氮的最佳条件。本文所用实验方法及评价标准可望为土壤碱解氮测定最佳条件筛选提供参考。

1 实 验

1.1 试剂和仪器

试剂：0.01 mol/L盐酸标准溶液、40%氢氧化钠溶液、2%硼酸、铁粉、混合指示剂(溴甲酚绿∶甲基红=5∶1)，均为分析纯，天津市科密欧化学试剂开发中心；超纯水，自制。

仪器：K1100F全自动凯氏定氮仪，海能仪器有限公司；AY120电子天平，岛津公司；玛瑙研磨钵。

1.2 实验方法

1.2.1 土壤碱解氮的测定

称取经过孔径筛的风干土壤与1 g铁粉在玛瑙研磨钵中均匀研磨后装入消化管置于定氮仪，将40%氢氧化钠溶液、2%含有混合指示剂的硼酸溶液、0.01 mol/L标准盐酸溶液和超纯水连接定氮仪；并设置有效参数进行测试；待消化管内的液体呈黑色，蒸馏完全后，用0.01 mol/L的盐酸标准溶液滴定接收杯中的馏出液，由蓝色变为紫红色为尽头，记录滴定体积。同时做3次空白对照实验。

1.2.2 碱解氮含量、绝对偏差、准确度及精密度的计算公式

凯氏定氮法测定碱解氮含量的允许偏差见表1，土壤碱解氮含量、绝对偏差、准确度及精密度计算公式如下所示。

表1 允许偏差Table 1 Margin of error

d=Ci-Cs

式中：WN为土壤碱解氮的含量，mg/kg；V和V0分别为滴定样品溶液和空白溶液所用标准盐酸溶液的体积，mL；c为盐酸标准溶液的浓度，mol/L；14为氮原子的毫摩尔质量，mg/mmol；m为风干土壤质量，g；d、Ci和Cs分别为碱解氮含量绝对偏差、标准物质单次测量值和标准物质推荐值，mg/kg；RE和RSD分别为准确度和精密度，%；n为每个标准物质测量次数。

1.2.3 单因素实验

为了准确测定土壤碱解氮，通过正交实验优化出最佳测定条件。合理确定碱解氮测定的影响因素尤为重要，其中铁粉、混合指示剂的硼酸和蒸馏水的用量有相对固定的要求，铁粉、混合指示剂的硼酸和蒸馏水分别为1 g、15 mL和30 mL。因此，以上三个影响因素不作考虑。选取称样量、40% NaOH溶液用量和蒸馏时间为自变量，参考LY/ T 1228-2015(4)森林土壤氮的测定确定设计三因素三水平正交实验。

标准物质多用于多目标区域地球化学调查与评价、土壤地力调查与评价及生态环境研究土壤有效态样品分析的量值及质量监控标准[5]。选取国家一级标准物质GBW07413a(ASA-2a)重复析5次，绝对偏差的平均值为实验指标(Y mg/kg)，最终得到实验指标值越低，则表明单因素的水平条件更优。

1.3 正交实验

根据正交实验的设计原理，参照LY/T 1228-2015(4)森林土壤氮的测定，综合单因素分析结果确立正交实验因素水平，采用正交实验对土壤碱解氮的测定条件进行优化筛选，并将最佳实验方法进行验证。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验影响

2.1.1 称样量的影响

分别称取1、2、3、4、5 g土壤与1 g的铁粉研磨混合后置于消化管中，设置定氮仪的参数(40%氢氧化钠溶液45 mL、硼酸15 mL、纯水30 mL、蒸馏时间6 min)进行测试，称样量对土壤碱解氮绝对偏差的影响如图1所示。

图1 称样量对土壤碱解氮绝对偏差的影响Fig.1 The effect of weighing sample on the absolute deviation of alkali-hydrolyzabla nitrogen content in soil

由图1可知，测得土壤碱解氮的绝对偏差均在允许偏差(表1)范围内，随着称样量的增加绝对偏差呈现出先降低后升高的趋势，当称样量达到2 g时绝对偏差最低，随后绝对偏差明显升高。因此，称样量的水平应设置为1～3 g。

2.1.2 NaOH溶液用量的影响

称取2 g样品与1 g还原性铁粉置于消化管中，设置凯氏定氮仪的参数，其中氢氧化钠溶液用量5、15、25、35、45 mL，其余参数分别为硼酸15 mL、纯水30 mL、蒸馏时间6 min上进行测试，40% NaOH溶液用量对土壤碱解氮绝对偏差的影响如图2所示。

图2 40%NaOH溶液用量对土壤碱解氮绝对偏差的影响Fig.2 The effect of 40% NaOH solution on the absolute deviation of alkali-hydrolyzabla nitrogen content in soil

由图2可知，5 mL 40% NaOH溶液时碱解氮含量的绝对偏差超出允许偏差(表1)范围，在15～45 mL时的绝对偏差均在允许范围内，用量在15 mL和45 mL时绝对偏差相差不大，为了避免不必要的浪费，选取40% NaOH溶液用量的水平应设置为15～35 mL。

2.1.3 蒸馏时间的影响

分别称取1 g样品与1 g的铁粉研磨混合后置于消化管中，设置凯氏定氮仪的参数，其中蒸馏时间2、3、4、5、6 min，其余参数分别为氢氧化钠溶液用量25 mL、硼酸15 mL、纯水30 mL、上进行测试，蒸馏时间对土壤碱解氮绝对偏差的影响如图3所示。

图3 蒸馏时间对土壤碱解氮绝对偏差的影响Fig.3 The effect of distillation time on the absolute deviation of alkali-hydrolyzabla nitrogen content in soil

由图3可知，随着蒸馏时间的延长，土壤碱解氮测得的绝对偏差先逐渐减小，在4 min达到最低值，而后逐渐升高；蒸馏时间在2 min和6 min时，绝对偏差超出允许偏差(表1)范围。因此，蒸馏时间的水平应设置为4～5 min。

2.2 正交实验分析

2.2.1 实验因素与水平的确立

依据单因素实验结果分析可知，设置实验因素及水平范围，列于表2中。其中自变量A、B和C分别为称样量、NaOH溶液用量和蒸馏时间。

表2 正交实验因素水平Table 2 Orthogonal test factor and level setting

2.2.2 正交实验表安排及实验结果分析

采用正交实验助手软件对正交实验L9(33)结果(表3)进行实验，建立响应值(Y)与称样量(A)、40% NaOH(aq)用量(B)和蒸馏时间(C)3个因素变量之间的关系，并对极差进行分析。

表3 正交实验表安排及实验指标分析Table 3 Orthogonal test table arrangement and experiment result analysis

续表3

通常，极差反应各因素水平变化对实验指标的影响。极差越大，代表着在该因素条件下的水平对指标的影响越大[6]。F比值的大小影响各因素水平实验指标的判断。当因素的F比值大于F(0.1)临界值时，则表明该因素对实验影响显著。由极差分析和F值可得，影响土壤碱解氮含量的因素依次为：40% NaOH溶液mL>蒸馏时间 min>称样量g。最佳测定方法为：A1B2C2，即为称样量1 g、40% NaOH溶液25 mL和蒸馏时间4 min。

40% NaOH溶液的用量对测得土壤碱解氮含量影响最大，成为准确测定土壤碱解氮的关键。测定碱解氮的原理是通过碱液处理土壤进行水解，它是铵态氮、硝态氮、氨基酸、酰胺和易水解的蛋白质的总和。当40% NaOH溶液用量过低或过高时，分别造成土壤水解不完全和不属于碱解氮成分的难水解蛋白质发生部分水解，致使绝对偏差均发生偏高现象[7]。

其次，影响土壤碱解氮测定含的是蒸馏时间。蒸馏时间对土壤溶液在蒸馏的过程中氨气是否蒸馏完全产生直接影响，从而致使滴定体积存在明显偏差。当蒸馏时间为2～3 min时，由于蒸馏时间过短而造成碱解氮含量偏低，样品中仍有部分未被蒸馏完全的铵态氮等存在；延长蒸馏时间至5～6 min时，虽能将土壤溶液中铵态氮等全部蒸馏出来，但滴定时间过长也会引起一部分氮元素损失。因此，蒸馏时间一般为4 min时最为适宜。此时，测定碱解氮含量的绝对偏差最小，测得土壤碱解氮含量最为精确。一般地，当蒸馏时间达到土壤样品能够水解完全时，适当的减少蒸馏时间也可准确的测定土壤中的碱解氮含量。

称样量对测定土壤碱解氮含量的影响较小。一般地，称样量在1～2 g范围内对碱解氮影响不大，均能准确测定碱解氮含量。

2.3 验证土壤碱解氮最佳测定方法

根据正交实验筛选出土壤全氮最佳测定方法确定为：称样量1 g、40% NaOH溶液15 mL和蒸馏时间4 min。为验证土壤碱解氮最佳测定方法的可靠性，利用以上最佳测定方法进行10种土壤有效态成分分析标准物质(ASA系列)重复进行12次碱解氮含量测实验证，测定的土壤碱解氮(如表4所示)均在允许偏差范围内。证明采用正交实验筛选出的土壤碱解氮最佳测定方法较为合理。

表4 土壤碱解氮最佳测定方法的测定结果Table 4 The results of the best method for the determination of alkali-hydrolyzabla nitrogen content in soil

3 结 论

通过参考LY/T 1228-2015(4)森林土壤氮的测定，为正交实验的因素与水平设置提供了参考范围。应用正交实验结合全自动凯氏定氮仪对土壤碱解氮测定条件的影响依次为：40% NaOH溶液mL>蒸馏时间 min>称样量g。土壤碱解氮最佳测定方法确定为：称样量1 g、40% NaOH溶液25 mL和蒸馏时间4 min。

以最佳测定方法进行土壤成分分析标准物质(ASA系列)验证，测定的土壤碱解氮均在允许偏差范围内。证明本研究所用实验方法及评价标准可用于优化土壤碱解氮最佳测定方法。