动物源性饲料原料中挥发性盐基氮检测方法的优化

刘丹丹，杨婧芳，侯林丛，陆 静，孙世雯，向霞霞

（1.河南海瑞正检测技术有限公司，河南郑州450001；2.安阳市动物卫生监督所）

动物源性饲料原料在腐败过程中，由于酶和细菌的作用，蛋白质分解而产生的氨以及胺类等碱性含氮物质被称作挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N)[1～4]。此类物质具有挥发性，其含量越高，表明氨基酸被破坏的越多，对产品营养价值影响越大[5～7]。

TVB-N 是评价动物源性饲料原料质量和新鲜度的一个重要指标[8～14]，已使用该指标在饲料行业中进行评估动物性饲料原料及其饲料产品的新鲜度，并且鱼粉、肉骨粉、血球粉等饲料原料的国家标准[15～17]中规定了TVB-N 的限量值，因此TVB-N 项目检测结果就显得尤为重要[4]。本研究通过对TVB-N检测过程中关键参数进行优化，旨在研究出操作简单、快捷、准确性高、稳定性好的检测方法。

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂

1.1.1 仪器

样品粉碎机（DFY-200C，温岭市林大机械有限公司）、分样筛（40 目、60 目）、分析天平（感量0.1mg）、数控超声波清洗器（KQ-250DE 型，昆山市超声仪器有限公司）、摇床（SHA-C）、电炉、离心机（JW-1042，安徽嘉文仪器装备有限公司）、酸式滴定管（最小分度值为0.1mL）、锥形瓶（250mL）、容量瓶（50mL）、定氮装置。

1.1.2 试剂

水（符合GB/T 6682 中三级用水的要求）、高氯酸溶液（0.1mol/L、0.6mol/L、1.2 mol/L）、氢氧化钠溶液（40g/L）、盐酸标准溶液（0.01mol/L）、硼酸吸收液（10g/L）、硅油消泡剂、(NH4)2SO4溶液、混合指示剂（甲基红0.1%乙醇溶液与溴甲酚绿0.5%乙醇溶液等体积混合，临用前配制）、甲基红指示剂（10g/L）。

1.2 方法

1.2.1 样品的采集和制备

按照GB/T 14699.1 要求抽取有代表性的饲料原料样品，用四分法缩减取样，按照GB/T 20195 制备样品，粉碎后，分别过40 目、60 目分析筛，混匀，装入磨口瓶中备用。

1.2.2 样品处理

称取试样5g（精确至0.1mg）于锥形瓶中，分别加浸提试剂40mL，浸提后，将试样及试样浸提液完全转移至50mL 容量瓶，并用浸提液定容，摇匀；取约30mL 试样浸提液于50mL 离心管中，离心（3 500r/min）5min，取上清液待测（如不能及时检测，于2℃-6℃的条件下贮存，可保存24h）。

1.2.3 定氮操作

取硼酸吸收液30mL 注入锥形瓶内，加混合指示剂3 滴，并将锥形瓶置于半微量定氮器冷凝管下端，使其下端插入硼酸吸收液的液面下。吸取浸提上清液10mL，注入半微量定氮器反应室内，于蒸汽发生装置加入甲基红指示剂2 滴，在样品反应装置中加入硅油消泡剂2 滴和氢氧化钠溶液10mL，然后迅速加塞，并加水密封，防止漏气。通入蒸汽进行蒸馏，当馏出液达到150mL 左右时，将冷凝管末端离开吸收液面，继续蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液并入锥形瓶内，然后停止蒸馏。

1.2.4 滴定

用盐酸标准溶液滴定至溶液由蓝绿色变成灰红色为终点，同时，用浸提试剂10mL 代替浸提上清液进行空白试验。

2 结果与分析

2.1 不同粉碎粒度对检测效果的影响

分别取未粉碎、粉碎过40 目筛和60 目筛的试样，按上述检测步骤进行分析，每种处理情况测试5个平行样品。测试结果见表1。由表1 可知，未粉碎处理的样品与粉碎过40 目筛、60 目筛样品相比存在显著差异(P＜0.05)；而粉碎至40 目、60 目时样品处理间差异不显著(P＞0.05)。

2.2 不同浸提试剂对检测效果的影响

表1 不同粉碎粒度对挥发性盐基氮检测结果的影响

在确定了样品粉碎粒度为40 目的基础上，研究比较了不同浓度的高氯酸溶液（0.1mol/L、0.6mol/L、1.2 mol/L）对试样中TVB-N 的提取效果，每种处理情况测试5 个平行样品，其结果如表2所示。

由表2 可知，随着高氯酸溶液浓度的增加，样品浸提液的pH 值逐渐降低，可能存在的微生物和酶活性继续腐败受到抑制，TVB-N 值呈现逐渐降低的趋势。但提取试剂浓度为0.6mol/L 与1.2 mol/L 样品提取液pH 值均在2.0 以下，且测定的TVB-N 含量比较稳定，说明TVB-N 的提取达到了很好的效果。但从实验室安全性、节约成本及环境友好角度考虑，本研究选择0.6 mol/L 高氯酸溶液作为提取剂。

表2 不同浸提试剂对挥发性盐基氮检测结果的影响

2.3 不同浸提方式和时间对检测效果的影响

在确定了样品粉碎粒度为过40 目筛，浸提试剂为0.6 mol/L 高氯酸溶液基础上，研究比较了不同浸提方式（超声浸提、振摇浸提）和时间（10min、20min、30min、40min）对试样中TVB-N 的提取效果，其结果如表3 所示。

结果表明，超声波浸提20min 与超声波浸提30min、振摇浸提30min 或振摇浸提40min 测得样品中TVB-N 含量差异不显著(P＞0.05)。因此，考虑到节约时间成本，提高浸提效率，超声波浸提20min比较合适。

表3 不同浸提方式及时间对挥发性盐基氮检测结果的影响

2.4 准确度和精密度

2.4.1 加标回收试验

取一定浓度(NH4)2SO4溶液加入鱼粉、猪肉粉及鸡肉粉中，测定试样中TVB-N 的含量，每个梯度重复测定5 次，结果见表4。测定的加标回收率在95.11%～105.45%之间，符合检测要求。

2.4.2 重现性试验

分别取鱼粉、猪肉粉及鸡肉粉样品，测定试样中TVB-N 的含量，每个样品重复测定5 次，计算其标准偏差及变异系数，结果见表5。结果表明，该检测方法重现性好，满足测定要求。

表4 加标回收试验结果

表5 精密度测定结果

3 讨论

3.1 不同粉碎粒度对检测效果的影响

本试验结果表明，动物源性饲料原料的粉碎粒度对试样中TVB-N 的测定结果影响较大，未粉碎处理的样品与粉碎过40 目筛、60 目筛样品中TVB-N 的测定结果相比存在显著差异(P＜0.05)，原因为粉碎的样品与浸提试剂接触面积更大，提高了TVB-N 的浸提效率，使检测结果更能体现样品本身的TVB-N 含量；而粉碎至40 目与60 目时样品处理间差异不显著(P＞0.05)，说明粉碎至40 目时，样品在浸提之后测定的TVB-N 的结果已经相对可靠，能够体现样品本身的新鲜度，该研究结果与Wang等[10]研究结果一致。因此，动物源性饲料原料中TVB-N 的数值与样品的粉碎粒度密切相关，粉碎粒度达到一定程度，有利于TVB-N 的测定。

3.2 不同浸提试剂对检测效果的影响

研究表明，提取试剂的浓度对试样中TVB-N的测定结果具有一定的影响。本试验采用0.6mol/L高氯酸溶液作为浸提试剂的原因：一是该试剂可以有效沉淀物源性饲料原料中的蛋白质，有效防止样品中蛋白质对测定结果的干扰；二是该试剂pH 较低，对酶活有一定的抑制作用，同时具有杀菌和抑菌作用，因此，可以延长待测液保存时间，还可以有效降低由于细菌或酶对样液中蛋白质的分解对TVB-N 检测结果的影响。该研究结果与季天荣等[4]研究结果一致，因此，该试剂在一定程度上能保证检测结果的可靠性。

3.3 不同浸提方式和时间对检测效果的影响

研究表明，不同浸提方式和浸提时间对检测结果有一定的影响。试验结果表明，超声波浸提20min与超声波浸提30min、振摇浸提30min 或振摇浸提40min 测得样品中TVB-N 含量差异不显著(P＞0.05)。本研究采用超声波浸提20min 进行提取，不仅节约了时间，提高了工作效率，同时也有效防止因浸提时间过长，导致样品在浸提过程中产生的进一步腐败，保证了检测结果的准确性。

3.4 准确度和精密度

本试验结果表明，优化后的检测方法测定的鱼粉、猪肉粉、鸡肉粉中TVB-N 的加标回收率及变异系数均符合相关标准要求，具有较高的准确度和精密度。主要原因：一是在样品处理时，优化法将样品粉碎达到过40 目筛的标准，选用0.6 mol/L 高氯酸溶液作为浸提剂，提高了样品与浸提剂的接触面积，提高了TVB-N 的溶出效率，提高了检测结果的准确度、可靠性；二是采用超声波浸提的方式，提高了浸提效率，缩短了提取时间，减少了试验过程中的前处理因素给试验结果带来的影响，进一步提高试验结果的准确性和重复性。

4 结论

本试验通过优化动物源性饲料原料中挥发性盐基氮的含量测定过程中的关键参数，确定了试样达到过40 目筛的粉碎程度、浸提液选取0.6 mol/L高氯酸溶液、超声波浸提20min 时，试样中的挥发性盐基氮的检测结果的准确度高、重现性好。研究表明，该操作方法简便、快速，有很高的准确度和精密度，适宜于大批量样品的处理与检测，应用前景广阔。