幼龄反刍动物消化道微生物演替与消化道发育调控

俞少博 杨 斌 王珊珊 王佳堃

（浙江大学奶业科学研究所，浙江杭州310058）

反刍动物消化道存在数量巨大、种类繁多的共生 微生物，使消化道成为动物体内最复杂的微生物“库”。微生物是引起机体免疫反应的重要抗原物质来源，因此，消化道是动物体接触外界环境中抗原物质最广泛的部位。在长期的共生关系中，宿主与消化道微生物之间形成了互利共生的关系。一方面，微生物能辅助动物体消化利用饲料底物、抑制病原菌定植以及维持消化道内环境稳态；另一方面，消化道微生物也能够刺激宿主的免疫系统，使宿主对消化道内定植的微生物产生选择作用。共生微生物如何在动物的消化道功能发育中起重要的介导作用，通过调控消化道微生物定植的手段能否促进消化道功能发育是当前的研究热点。为此，本文在重点综述消化道微生物演替与消化道功能分化关系的基础上，阐述了日粮和瘤胃微生物移植对幼龄反刍动物消化道微生物演替和消化道器官发育的调节作用。

1 消化道微生物演替与消化道功能分化的关联

消化道微生物在宿主生理和发育过程中扮演重要角色。消化道微生物及其代谢产物参与宿主消化道形态结构及其免疫系统的发育调节。

1.1 消化道微生物促进宿主免疫系统发育

消化道黏液层和消化道黏膜相关淋巴组织共同组成肠道免疫防线，而消化道微生物通过刺激杯状细胞分泌黏蛋白，保证黏液层完整；通过活性树突状细胞诱导消化道黏膜相关淋巴组织发育；通过调节免疫细胞分化维持机体免疫平衡，实现了消化道微生物对宿主免疫系统功能的调节。

1.1.1 消化道微生物刺激杯状细胞分泌黏蛋白

消化道黏液层由杯状细胞分泌的黏蛋白组成，覆盖于上皮细胞表面。一方面，黏液层具有润滑作用，利于消化道蠕动和食糜消化；另一方面，由黏蛋白分子构成的网状结构能够有效阻止细菌移位（bacterial translocation，BT）。细菌移位是细菌侵入消化道上皮黏膜，经淋巴管、肠系膜淋巴结最终进入脏器和血液循环的过程，可能触发全身性免疫反应和多系统器官功能衰竭[1]。当黏液中缺少黏蛋白或含有的黏蛋白发生糖基化异常时，可能造成消化道屏障功能受损、通透性增加、细菌在黏液层快速增殖，从而产生细菌移位影响机体健康[2-4]。共生的消化道微生物能够刺激杯状细胞分泌足够的黏蛋白，保证肠道黏液层结构的完整性。研究表明，无菌动物模型中，结肠杯状细胞减少，使肠道黏液层变薄[5]；当肠道细胞暴露于细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）或肽聚糖（peptidogly⁃can，PGN）后，杯状细胞分泌的黏蛋白增加，黏液层厚度恢复至正常水平[6]。

1.1.2 消化道微生物刺激肠道淋巴组织发育

反刍动物肠道中，集合淋巴小结（又称派伊尔淋巴结，peyer’s patches，PP）、孤立淋巴滤泡（isolated lymphoid follicles，ILF）和肠系膜淋巴结（mesenteric lymph nodes，MLN）共同构成肠道淋巴组织（gut-asso⁃ciated lymphoid tissues，GALT）[7]。树突状细胞（den⁃dritic cells，DC）通过其表面的Toll样受体（toll-like re⁃ceptors，TLR）识别细菌及其代谢产物后，进一步激活MAL-MYD88和TRAM-TRIF 信号通路，使DC细胞活化。活化的DC 细胞具有三种主要的功能：①能够促进PP生发中心的T细胞增殖，进一步促进B细胞分化并分泌IgA；②通过淋巴血管迁移至MLN，诱导MLN中的效应T细胞增殖，促进MLN的发育过程；③DC细胞也能刺激B细胞增殖并募集T细胞，促进隐窝小结发育成为成熟的ILF[8]。Hamada 等[9]报道发现无菌小鼠肠道的ILF发育不完全，而Bouskra等[10]研究表明革兰氏阴性菌的PGN可诱导无菌小鼠ILF的形成，说明革兰氏阴性菌可能通过TLR 受体介导细菌抗原的刺激，促进肠道免疫系统的发育。此外，不仅是革兰氏阴性菌的PGN，Toll 样受体各家族能够识别的抗原物质有所不同，如TLR4 能够识别革兰氏阴性菌产生的LPS；而TLR2 的配体包括脂蛋白、脂多肽、脂壁酸（LTA）、阿拉伯甘聚糖（LAM）及酵母多糖等；TLR3 能够特异识别病毒复制过程产生的ds-RNA；TLR9则能够特异性识别细菌的CpG-DNA。因此，通过刺激不同的TLR受体，几乎所有的共生微生物都可能通过产生抗原刺激宿主的肠道免疫反应，最终促进免疫系统的发育。

1.1.3 消化道微生物调节免疫细胞分化

T 细胞通过分化为辅助性T 细胞（helper T cells，TH）和调节性T 细胞（regulatory cells，Treg）分别对肠黏膜免疫屏障作用进行调节。肠道微生物中，分节丝状杆菌（segmented filamentous bacteria，SFB）能够直接刺激并诱导T 细胞分化为TH17 细胞[11]。SFB 定植后使肠道组织中血清淀粉样蛋白（serum amyloid A，SAA）表达量上调，刺激CD11c 细胞和DC 细胞产生IL-6和IL-23，从而促进TH17细胞发育[12]。病原菌菌鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimunum）能诱导T细胞分化为TH1细胞，TH1细胞能够产生IFN-γ激发机体的免疫反应抵御病原菌侵入。脆弱型拟杆菌（Bac⁃teroidesfragilis）细胞壁的成分细菌多糖A（polysaccha⁃ride A，PSA）能够刺激Treg细胞分化并分泌IL-10，抑制TH1和TH17细胞的免疫反应使免疫系统产生对该微生物的耐受。此外，梭状芽孢杆菌（Clostridium）Ⅳ家族和ⅪⅤα家族能够刺激结肠上皮细胞产生TGF-β，进一步诱导T细胞分化为Treg细胞，同样使宿主产生免疫耐受[13]。DC 细胞通过TLR 识别肠道细菌的过程中，TLR 激活下游的MAL-MYD88 和TRAM-TRIF 信号通路，产生细胞因子调节T 细胞向不同亚型分化。因此，不同的细菌可能通过刺激T细胞分化为不同的细胞亚型，实现肠道对共生细菌的免疫耐受与免疫反应的平衡调控。除细菌的直接调节外，肠道细菌产生的代谢产物，如短链脂肪酸、胆汁酸、维生素、多胺、脂质等，在进入肠道黏膜循环后能够直接刺激宿主免疫相关基因的表达（见表1）。

表1 常见的消化道细菌代谢产物及其免疫调节作用

1.2 消化道微生物促进宿主消化道结构发育

消化道微生物定植与消化道结构发育通常伴随进行，消化道微生物可能通过缺氧相关的信号通路、激活JAK-STAT 和JNK 途径或通过吡咯喹啉醌依赖醇脱氢酶（PQQ-ADH）介导胰岛素/胰岛素样生长因子信号通路调节肠道干细胞分化，最终促进肠道结构发育。

1.2.1 细菌介导缺氧诱发宿主发育

Coon等[22]研究发现无菌的蚊子幼虫，即便供应充足的营养，也仅能存活一龄，而相反，在有大肠杆菌等几种细菌存在情况下，孑孓就可发育为成虫。通过进一步的大肠杆菌基因筛选，发现大肠杆菌诱发宿主发育与细胞色素BD 氧化酶有关，该酶的存在可降低消化道中氧的水平，从而促进生长和蜕皮激素诱导蜕皮。消化道中细菌的有氧呼吸是蚊子发育过程必不可少的诱因。

1.2.2 细菌激活JAK-STAT 和JNK 途径调节肠道干细胞分化

JAK-STAT（Janus kinase -signal transducers and activators of transcription）信号通路由三个成分组成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等生物学过程。c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun NH2termi⁃nal kinase，JNK）又被称为应激活化蛋白激酶(stressactivated protein kinase, SAPK)，参与细胞周期、生殖、凋亡和应激等多种生理和病理过程。Buchon 等[23]研究发现，无菌果蝇有丝分裂的肠道干细胞数量和肠道上皮更新速度均低于正常饲养的果蝇，而且发现消化道里的微生物通过维持JAK-STAT 和JNK 信号途径的基本活性，使消化道上皮更新处于正常水平。当病原微生物入侵时，JAK-STAT 和JNK 信号途径被过度激活，加速上皮更新。因此，JAK-STAT和JNK信号通路在肠道干细胞增殖分化的过程中起调节作用，微生物通过上述途径可能影响肠道结构发育

1.2.3 PQQ-ADH 介导细菌调节胰岛素/胰岛素样生长因子信号途径调控肠道干细胞分化

吡咯喹啉醌依赖醇脱氢酶（pyrroloquinolinequi⁃none-dependent alcohol dehydrogenase，PQQ-ADH）是醋酸菌乙醇氧化呼吸链中的主要脱氢酶，它参与乙酸生成。Shin 等[24]通过构建果蝇消化道微生物的突变体，测试了消化道微生物对宿主发育的影响。研究发现对宿主发育构成影响的微生物突变体都会减少或严重抑制乙酸的生成，推测微生物的乙酸生成能力是影响宿主发育的主要因素，且PQQ-ADH 呼吸链在调节胰岛素/胰岛素样生长因子信号途径调控肠道干细胞分化中扮演重要角色。

2 日粮调控消化道微生物定植与消化道器官发育

日粮是影响瘤胃发育的重要因素之一。瘤胃的发育始于固体饲料的进食[25]，一方面，固体饲料能够提供必要的物理刺激；另一方面，固体饲料能够在瘤胃中长时间停留发酵，因此能够促进瘤胃微生物的定植和发酵产物的生成，进而促进瘤胃发育。

2.1 精料对消化道微生物与消化道发育的调控

精料能够提高瘤胃内Prevotella、Ruminobacter⁃amylophilus、Succinimonasamylolytica 和Succinivibrio⁃dextrinosolvens 等淀粉和糖类分解菌的相对丰度，使碳水化合物在瘤胃中迅速发酵产生挥发性脂肪酸（volatile fatty acids，VFA）。高精料日粮使瘤胃上皮单羧酸转运载体1、NHE1、NHE3的表达量显著上调，单羧酸转运载体4 的表达量显著下调[26-27]，从而促进瘤胃上皮对VFA 的吸收。VFA 能够促进瘤胃上皮细胞分化和增殖，其中以丁酸的作用效果最优，丙酸次之[28-30]。有研究表明，丁酸能够促进胰岛素样生长因子（IGF-1）、表皮生长因子（EGF），以及生长激素（GH）、胰岛素（Insulin）和胰高血糖素（Glucagon）等激素的释放，促进瘤胃上皮的发育[31]。然而，Suárez等[32]研究发现，只饲喂精料条件下，牛瘤胃中会形成食糜黏附和瘤胃乳头聚集，降低了瘤胃的吸收面积影响营养物质吸收，不利于瘤胃的健康。因此，使用纯精料刺激瘤胃发育可能影响反刍动物的健康，在开食料中添加少量的粗饲料可能能够缓解精料引起的负面效果，既促进瘤胃发育同时保证瘤胃健康。

2.2 粗饲料对消化道微生物与消化道发育的调控

粗饲料中富含纤维素，饲喂粗饲料能够增加瘤胃中纤维分解菌的相对丰度[33]。然而，不同的粗饲料来源对瘤胃微生物的影响不同。Saro等[34]对比了饲喂苜蓿和饲喂黑麦干草的绵羊瘤胃中Fibrobacter succino⁃genes、Ruminococcusflavefaciens 和真菌等纤维分解菌的丰度发现，苜蓿组中纤维分解菌的相对丰度显著高于黑麦干草组（P＜0.05）。Zhang 等[35]在泌乳中期奶牛日粮中分别添加玉米秸秆、羊草和苜蓿三种不同的粗饲料，结果显示饲喂苜蓿组的奶牛瘤胃中Prevotella和Selenomonas的相对丰度显著高于玉米秸秆组的奶牛（P＜0.05），而和饲喂苜蓿或羊草的奶牛相比，饲喂玉米秸秆的奶牛瘤胃中Anaerotruncus、Papillibacter、Thermoactimoyces、Bacillus和Streptomyces的相对丰度较高（P＜0.05）。

在饲喂精料的过程中补饲粗料可以提高幼龄反刍动物日增重、胴体重和瘤胃健康水平[36-37]，补饲粗料的效果受粗料类型、纤维长度以及补饲量的影响[38-39]。本课题组以湖羊为研究对象，研究了粗饲料的早期补饲对幼龄反刍动物瘤胃发育的影响。饲养试验结果显示，羔羊出生后10 d补饲苜蓿能够提高断奶前后开食料和粉状精料的采食量和营养物质摄入量，增加幼龄反刍动物的体重、日增重、胴体重，促进前胃和脏器的发育，减少瘤胃壁食糜黏附[40]。

这一过程中补饲苜蓿使瘤胃微生物区系在断奶前趋近于断奶后的微生物区系，减少断奶前后细菌丰度的波动变化，从而促进羔羊对断奶后日粮的适应性，减少断奶应激[41]。相比于对照组，补饲苜蓿的羔羊在断奶前的细胞代谢过程、细胞定位、生物质量调控等功能较强；并通过瘤胃组织中钙信号通路、支链氨基酸降解和脂肪酸代谢等通路上调，促进瘤胃的早期发育[42]。

3 微生物移植对消化道微生物与消化道发育的调控

“粪 菌 移 植”（Fecal microbiota transplantation，FMT），是指将健康供体的粪便微生物移植到患病受体的胃肠道内重塑受体肠道菌群结构来治疗特定疾病的方法。瘤胃微生物移植可在一定程度上改善饲料利用效率，加速消化道免疫耐受。

3.1 瘤胃微生物移植改善饲料利用效率

反刍动物瘤胃中存在大量具有纤维降解能力的微生物，能够帮助宿主有效利用纤维物质。近年来，研究者通过微生物移植，促进瘤胃微生物的定植过程来提高反刍动物生产效率。新生反刍动物的瘤胃在出生后数分钟即有微生物定植，即使未采食固体饲料，一周内也可在瘤胃内检测到纤维降解菌。但这时的瘤胃尚不能承担纤维的降解功能，而是随着日龄增长，多样性更丰富、生态结构更稳定的瘤胃微生物菌群担负起纤维降解的功能。虽然幼龄反刍动物消化道中早期定植的微生物不一定发挥其应有的功能，但是作为瘤胃功能的重要参与者，早期定植的微生物可能在个体适应固体饲料的过程中发挥作用，以减少断奶应激产生的负面作用。Ishaq 等[43]通过将野生动物消化道内分离出的具较强纤维降解能力的微生物饲喂给幼龄反刍动物，改善了幼龄反刍动物的瘤胃发酵和饲料利用效率。

作为成熟瘤胃功能的载体，成年瘤胃微生物应该是一种幼龄反刍动物微生物移植的供体来源。相比于特定的微生物制剂，瘤胃微生物移植在提早引入大量新微生物的同时，可能加速消化道微生物的定植过程，甚至影响后肠的消化功能和机体的免疫作用。Zhong 等[44]给羔羊移植成年瘤胃微生物，增加了羔羊0～56 日龄的平均日增重，并且提高了饲料效率。Yu 等研究发现断奶前移植更有助于瘤胃微生物“成熟”[45]，瘤胃微生物移植可提高瘤胃中丙酸的供应[46]。Barbieri 等[47]进一步测试了饲料和供体瘤胃微生物对羔羊瘤胃微生物定植的影响，发现饲料对瘤胃微生物区系的影响要大于微生物移植，产生更长远的影响。

3.2 瘤胃微生物移植加速消化道免疫耐受机制建立

相比于瘤胃，肠道在幼龄反刍动物消化功能的作用也越来越受到关注，微生物在后肠中也能进行发酵，产生的VFA，尤其是丁酸，可以促进肠道上皮发育，改善肠道的屏障功能[48]。与此同时，移植进入的微生物也具有很强免疫原性，其可能通过调节肠道免疫过程对宿主产生影响。早期的研究证明，不管是高压灭菌的瘤胃液、冻干瘤胃液、瘤胃液离心后的上清液等，在移植进入幼龄反刍动物消化道内后，能显著降低腹泻发生的概率，这从侧面反映了瘤胃液作为一种免疫制剂，可能影响个体的肠道功能[49]。在单胃动物的研究中发现，采食粗纤维可以加速肠道纤维素利用菌的定植，并增加挥发性脂肪酸的产生，这一过程加速了肠道上皮维生素A转化酶的表达，且这一特定酶与肠道致耐受性的树突状细胞增殖有关[50]。在反刍动物生长前期，为了抵消不必要的免疫反应产生的能量损耗，反刍动物肠道可能存在对特定瘤胃微生物的耐受机制，提前移植的成年瘤胃微生物也可能加速肠道免疫耐受机制的建立，从而改善动物的肠道健康。

4 小结

消化道微生物在消化道形态结构发育和肠道免疫系统调节的过程中发挥重要作用，受到广泛关注。然而，宿主如何识别微生物及其代谢产物，及不同信号途径介导微生物对消化道发育调节作用的权重仍未可知。日粮和瘤胃微生物移植如何助推幼龄反刍动物消化道微生物演替与消化道发育仍需深入研究。