白术茯苓多糖复方对断奶仔猪盲肠微生态结构的影响

陈丽玲 贺 琴 郭晓波 卢亚飞 罗波文 王自蕊 游金明*

（1.江西农业大学 江西省动物营养重点实验室江西省优质安全畜禽生产产教融合重点创新中心，江西南昌330045；2.江西中医药大学，江西南昌330004）

肠道微生物跟仔猪健康生长密切相关。大肠，尤其盲肠是猪的主要发酵器官，其微生物发酵集中于大肠的前部，盲肠及近端结肠对碳水化合物的发酵量占大肠总发酵量的92%。大肠的发酵功能与反刍动物的瘤胃有相似的地方，都可以有效消化日粮中的粗纤维。仔猪断奶时因饲料类型及环境的变化易导致仔猪肠道微生态结构的改变，从而影响仔猪消化吸收性能，同时也将影响机体的免疫力。因此，保持肠道内微生物组成的相对稳定，尤其是有益菌比例高于有害菌，有利于仔猪健康生长和正常生产。在饲粮中添加中草药多糖可在一定程度上调节畜禽肠道微生态结构。王琳（2018）研究发现，在育成鸡饲粮中添加0.2%～0.6%白术多糖能显著降低盲肠中的大肠杆菌含量，并提高盲肠双歧杆菌和乳酸杆菌含量。白术多糖也能改善和调节肠道菌群失调，提高厌氧培养的肠道细菌对糖类的消化能力。参苓白术丸可显著降低高脂血症豚鼠疣微菌门的比例，并显著增加高脂血症豚鼠瘤胃球菌属-1 和Ileibacterium 韦荣球菌属的比例，降低产粪甾醇真杆菌及嗜黏蛋白-艾克曼菌的比例。但白术多糖和茯苓多糖配合使用是否能够发挥协同作用，目前在畜禽研究中鲜有报道。因此，本研究采用HiSeq 测序平台对断奶仔猪盲肠内容物的微生物群落DNA 片段进行双端（Paired-end）测序，旨在探讨饲粮中添加白术茯苓多糖复方对仔猪盲肠微生物多样性和微生物结构的影响，进而为探讨白术茯苓多糖对断奶仔猪肠道屏障功能的调节作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

白术多糖和茯苓多糖由四川某公司提供，多糖含量均为37.5%，剩余部分为糊精。白术多糖和茯苓多糖在使用前按照1∶1预先混合后待用。

1.2 试验动物和分组设计

选取150 头体重接近的23 日龄杜×长×大断奶仔猪，按照完全随机设计方法分为6 个处理，每个处理5个重复，每个重复5头仔猪。6个处理组分别饲喂添加抗生素饲粮（硫酸粘杆菌素20 mg/kg+杆菌肽锌40 mg/kg+喹乙醇100 mg/kg）、空白组饲粮（既不添加任何抗生素也不添加白术茯苓多糖复方）及分别添加0.02%、0.04%、0.06%、0.08%白术茯苓多糖的试验组饲粮。试验期27 d。

1.3 试验饲粮和营养水平

仔猪饲喂玉米-豆粕型饲粮。饲粮配方参照NRC（2012）和我国猪饲养标准（2004）配制。

1.4 饲养管理

仔猪饲养于装有高床、漏缝地板、乳头式饮水器的保育舍。试验开始前对猪舍进行彻底清理消毒。试验过程中，每日饲喂4～5次。所有仔猪自由采食和饮水，其他饲养管理措施、免疫处理按猪场常规管理程序进行。

1.5 样品采集及处理

在试验第27 d，从每个重复中选取1头接近平均体重且健康状况良好的仔猪，用4%戊巴比妥钠麻醉。待麻醉完全后，对仔猪进行颈静脉放血，沿腹部中线剖开腹腔，取盲肠中段肠管，两端双线结扎，用锡箔纸和保鲜膜包裹后，做好标记，置于液氮中速冻，再转至-80 ℃保存。

1.6 测定指标及方法

盲肠内容物总DNA 提取：采用北京天根生物科技有限公司产品Tiangen-Magnetic Soil and Stool DNA Kit 试剂盒检测其DNA 纯度、浓度及质量，而后进行PCR 扩增、产物纯化、文库制备与库检、HiSeq上机检测。测序工作由北京诺禾致源科技有限公司完成。

盲肠菌群OTU 聚类分析：对样品优化序列进行OTU（Operational Taxonomic Units）聚类分析，将所有优化序列比对至OTU 代表序列，筛选与OTU代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU 分析结果。

盲肠微生物多样性分析：在考虑序列丰度的前提下，计算不同随机抽样下多样性指数（Shannon 指数、Simpson指数）和丰富度指数(Chao指数、Ace指数、Ob⁃served-species 指数)。采用GraphPad Prism(V.7.0.1)软件进行显著性检验。利用R Stodio（V.3.0.2）软件基于加权的UniFrac距离进行主成分分析。

盲肠微生物分类学统计：对OTU 代表序列进行分类学分析，并在门（phylum）、纲（class）、目（order）、科（family）、属（genus）5 个水平上统计每个样品的肠道菌群落组成。使用Wilcoxon 秩和检验对各处理组间微生物群落在门和属水平上进行假设检验，评估物种丰度的显著差异，分析组间显著性差异物种。

1.7 数据处理与统计分析

所有数据用Excel 2013 简单处理后，采用SPSS 17.0软件中单因素方差分析（One-way Anova）模型进行方差分析，各组数据以“平均值+标准误”表示，各处理组间的差异用单因素方差分析（One-way Anova）和Duncan's 法多重比较。以P＜0.05 为显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 仔猪盲肠菌群OTU聚类分析（见图1）

图1 仔猪盲肠微生物OTU分布Flower图

由图1 可知，抗生素组、空白组、0.02%白术茯苓多糖组、0.04%白术茯苓多糖组、0.06%白术茯苓多糖组和0.08%白术茯苓多糖组共有OTU 数为729，各组独有的OTU数分别为27、139、9、19、8和29。

2.2 仔猪盲肠微生物多样性分析（见表1、图2）

由表1 可知，通过Alpha 多样性分析，对比不同组的Shannon 指数发现，0.08%白术茯苓多糖复方组显著高于抗生素组、空白组和0.02%组（P＜0.05）；Simpson 指数空白组显著低于0.04%、0.06%和0.08%白术茯苓多糖复方组（P＜0.05），且0.08%组Simpson指数最高。丰富度指数Chao 指数、Ace 指数空白组均显著高于其他各组（P＜0.05）。通过Beta 多样性分析可知（见图2），各组重复性较好，抗生素组和空白组仔猪盲肠微生物多样性相似度高；0.06%和0.08%白术茯苓多糖复方组仔猪盲肠微生物多样性相似度高；0.06%和0.08%白术茯苓多糖复方组与空白组及抗生素组相比，盲肠微生物多样性相似度相对较低，尤其是与空白组相比，微生物多样性相似度最低。

表1 白术茯苓多糖复方对断奶仔猪盲肠微生物群落α-多样性的影响

图2 基于Unweighted Unifrac距离的UPGMA聚类树

2.3 仔猪盲肠微生物分类学分析（见表2～表3、图3～图4）

表2 白术茯苓多糖复方对仔猪盲肠微生物组成的影响(门水平，%）

表3 白术茯苓多糖复方对仔猪盲肠微生物组成的影响(属水平，%)

图3 仔猪盲肠微生物门水平上的物种相对丰度柱形图

由表2 和图3 可知，本试验条件下的仔猪盲肠Bacteroidetes（拟杆菌门）、Firmicutes（厚壁菌门）、Proteobacteria（变形菌门）和Spirochaetes（螺旋体门）相对丰度较高，属于优势菌门。Cyanobacteria（蓝藻菌门）、Tenericutes（软壁菌门）、Actinobacteria（放线菌门）相对丰度较低，属于劣势菌门。由图3 可知，与空白组相比，白术茯苓多糖复方各组能增加拟杆菌门和厚壁菌门的相对丰度（P＞0.05），抗生素组、0.02%、0.04%、0.06%和0.08%白术茯苓多糖复方组仔猪盲肠中变形菌门和放线菌门相对丰度显著降低（P＜0.05）；与抗生素组和空白组相比，添加0.02%和0.06%白术茯苓多糖复方能显著增加仔猪盲肠中蓝藻菌门的相对丰度（P＜0.05），而添加0.04%、0.06%和0.08%白术茯苓多糖复方能显著增加仔猪肠道中螺旋体门的相对丰度（P＜0.05）；与抗生素组相比，添加0.04%、0.06%和0.08%白术茯苓多糖复方能显著增加仔猪肠道中软壁菌门的相对丰度（P＜0.05）。

由表3 和图4 可知，以丰度＞1%为优势菌群划分依据，本试验Prevotella-9（普氏菌属-9）、Campylo⁃bacter（弯曲菌属）、Prevotellaceae-NK3B31（普雷沃氏菌属NK3B31）、Alloprevotella（拟普雷沃菌属）、Megasphaera（巨型球菌属）、Prevotella-1(普氏菌属-1)、Phascolarctobacterium（考拉杆菌属）、Buchnera（黑草属）、Leeia（奈瑟菌科Leeia属）是断奶仔猪盲肠优势菌属。与抗生素组相比，添加白术茯苓多糖复方各组的仔猪盲肠普氏菌属-9、巨型球菌属和黑草属相对丰度显著降低（P＜0.05）；与空白组和抗生素组相比，添加0.04%、0.06%和0.08%白术茯苓多糖复方能显著降低仔猪盲肠弯曲菌属的相对丰度（P＜0.05）。与抗生素组相比，0.02%白术茯苓多糖复方组仔猪盲肠的普雷沃氏菌属NK3B31、普氏菌属-1 相对丰度显著增加（P＜0.05）；0.06%白术茯苓多糖复方组的奈瑟菌科Leeia属相对丰度显著高于其他各组（P＜0.05）。

3 讨论

图4 仔猪盲肠微生物的物种丰度聚类热图

饲料养分进入动物胃肠道后，除了相关的消化液参与消化过程，大量的肠道微生物也参与其中。肠道内的乳酸菌属、梭菌属和拟杆菌属会将饲粮中的蛋白质、脂质和糖类分解成小分子，并被小肠吸收，而大分子蛋白质、多肽或膳食纤维会在大肠（盲肠、结肠和直肠）通过微生物作用被分解吸收。仔猪肠道微生物以盲肠最丰富，也最具有代表性。仔猪早期断奶应激会影响肠道正常菌群的建立；而消化酶分泌不足，未被消化吸收的食物残渣在后肠被变性菌门中的大肠杆菌等利用，有害微生物数量上升，造成肠道正常的微生态结构遭到破坏。白术或茯苓与其他中药配合使用能改善肠道微生态结构。白术多糖能促进益生菌如婴儿双歧杆菌和动物双歧杆菌的生长。曹俊敏等[10]发现用茯苓、三补、当归和白术治疗菌群失调小鼠，四种中药对小鼠正常菌群均有扶植作用，白术和三补能显著增加双歧杆菌的黏附性。但白术茯苓多糖复方对动物肠道微生态结构影响的报道极少。

试验动物品种不同、日粮组成不同，动物肠道菌群结构也各有差异。本试验采用Illumina HiSeq 平台对断奶仔猪盲肠微生物群落DNA 片段进行双端（Paired-end）测序，结果发现，与空白组相比，饲粮中添加0.04%和0.08%白术茯苓多糖复方的仔猪盲肠菌群多样性显著增加，但菌群丰富度显著降低，断奶仔猪盲肠微生物相对丰度前七的为Bacteroidetes（拟杆菌门）、Firmicutes（厚壁菌门）、Proteobacteria（变形菌门）和Spirochaetes（螺旋体门）、Cyanobacteria（蓝藻菌门）、Tenericutes（软壁菌门）、Actinobacteria（放线菌门），且抗生素组和白术茯苓多糖组的Bacteroidetes（拟杆菌门）和Firmicutes（厚壁菌门）是优势菌门，空白组优势菌为拟杆菌门和变形菌门。本试验结果与张本盛[11]、Pajarillo等[12]、Slifierz等[13]及杨利娜等[14]的研究结果类似，且拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）是优势菌门，与张本盛[11]、贺琴等[15]结果一致。空白组的优势菌为拟杆菌门和变形菌门。与空白组相比，抗生素组、0.02%、0.04%、0.06%和0.08%白术茯苓多糖复方组仔猪盲肠中变形菌门和放线菌门相对丰度显著降低。变性菌门是细菌中最大的一个门，包括很多病原菌，如大肠杆菌、沙门氏菌等致病菌。放线菌是属于有分支状菌丝体的一类细菌，革兰氏染色为阳性，少数放线菌能引起动物危害。本研究前期动物饲养过程中空白组的腹泻情况最为严重，这可能与空白组仔猪盲肠中变性菌门相对丰度增加有密切关系。饲粮中添加白术茯苓多糖复方能降低变形菌门的比例，可以减小一些致病菌对仔猪的危害，进而控制腹泻。另外，在猪肠道内拟杆菌和厚壁菌均有降解多糖和改进机体能量吸收的作用[16]，两者相对丰度的增加有利于仔猪对饲料养分的消化。本研究结果显示，相比于空白组，饲粮中添加白术茯苓多糖复方能提高断奶仔猪肠道拟杆菌门相对丰度，对厚壁菌门相对丰度也有一定的提高。

本试验还发现，与抗生素组相比，添加0.04%、0.06%和0.08%白术茯苓多糖复方各组的仔猪盲肠普氏菌属-9、弯曲菌属、巨型球菌属和黑草属相对丰度显著降低；0.06%白术茯苓多糖复方组的奈瑟菌科Leeia属相对丰度显著高于其他各组，0.02%白术茯苓多糖复方组仔猪盲肠的普雷沃氏菌属NK3B31、普氏菌属-1相对丰度显著增加。在属水平上，仔猪盲肠的主要菌属是普氏菌属，该结果与刘颖[17]报道的一致，其主要功能是降解植物细胞壁中的膳食纤维，产生数量丰富的短链脂肪酸由机体吸收。表明适宜的白术茯苓多糖复方可以在一定程度上改善仔猪的消化功能。

4 结论

抗生素组和白术茯苓多糖组的Bacteroidetes（拟杆菌门）和Firmicutes（厚壁菌门）是优势菌门，空白组优势菌为Bacteroidetes（拟杆菌门）和Proteobacteria（变形菌门）。与空白组相比，饲粮中添加白术茯苓多糖复方，一方面能显著降低仔猪盲肠中变形菌门相对丰度，减少仔猪感染致病菌的机会，另一方面提高了拟杆菌门相对丰度，促进了碳水化合物、脂肪等营养物质的消化吸收。在属水平上，仔猪肠道主要菌属是普氏菌属，0.02%白术茯苓多糖复方能显著提高仔猪盲肠普雷沃氏菌属NK3B31 和普氏菌属-1 相对丰度。由此可见，白术茯苓多糖在一定程度上能改善断奶仔猪盲肠的菌群结构。