复合菌系预处理稻秆半连续厌氧发酵产甲烷性能

潘云霞，刘思琪，贺亚清，向 阳

（西南大学工程技术学院，重庆 400715）

0 引 言

将秸秆厌氧发酵生产沼气是提高农业废弃物全量化和资源化利用的一种重要手段[1]。中国每年产生约10.4亿t 秸秆，若将其进行厌氧发酵生产沼气，不仅可解决焚烧带来的环境污染问题，还可缓解当前日益严峻的能源短缺问题。秸秆由纤维素、半纤维素和木质素通过化学键相互交联缠绕构成，这种致密结构会阻碍秸秆与微生物的接触[2]，致使秸秆的水解酸化成为整个厌氧发酵的限速步骤，为此，需对秸秆进行物理、化学或生物预处理[3-8]。生物预处理因反应条件温和、能耗低、易操作、环境友好等，备受研究者的青睐。

在生物处理中，单一菌易受产物抑制和发酵环境影响，造成产气不稳定[9-10]，复合菌系由于菌群间良好的协同作用，能较好的克服这些问题[11-13]，黄开明等[11]利用复合菌HK-4 预处理玉米秸秆15 d，纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别达到64.52%、51.06%和3.89%，沼气产量较未接菌的对照提高了27.4%；祝其丽等[12]利用复合菌AMC 预处理玉米秸秆3 d，沼气产量增加了6.89%；Sameh 等[13]利用复合菌处理木屑，沼气产量较对照提高86.4%。因此，利用复合菌对木质纤维素进行生物预处理，能有效提高厌氧发酵的沼气产量。但复合菌种类多，分泌的水解酶会导致发酵末端产物的多样化。在厌氧发酵过程中，有70%～80%的甲烷来自于乙酸的转化[14]，如果复合菌系能定向降解秸秆，使其转化为易被产甲烷菌利用的底物，将对提高厌氧发酵中沼气的品质具有重要作用。为此，实验室从新疆多年连作的棉田土壤和牛粪、稻秆发酵液中，通过限制性培养筛选得到一株能高效降解稻秆的复合菌系，通过高通量测序，并结合宏基因组技术，对复合菌系高效降解稻秆产酸机制进行研究，并将其用于半连续厌氧发酵，以提高稻秆厌氧发酵效率和沼气的品质。

1 材料与方法

1.1 试验材料

复合菌系是由本实验室从新疆多年连作的棉田和牛粪、稻秆发酵液中通过限制性培养方法筛选得到，使用前保存在-80℃冰箱。稻秆取自西南大学水稻研究所的试验田，将自然风干稻秆在1%氢氧化钠溶液中浸泡24 h，之后用自来水对浸泡稻秆反复冲洗，直至冲洗水的pH 值接近中性，将清洗后的稻秆置于80℃的鼓风干燥箱中进行干燥，之后剪成1 cm 的小段，存放在塑料袋中并置于干燥器中。蛋白胨纤维素培养基由蛋白胨5 g、NaCl 5 g、酵母提取物1 g 和CaCO32 g 构成。

1.2 试验方法

在蛋白胨纤维素培养基中加入20 g 稻秆和1 000 mL去离子水，pH 值调节至9，121 ℃灭菌20 min，冷却至室温后，接种3%的复合菌系，生物预处理稻秆3 d 产生的挥发性脂肪酸（Volatile Fatty Acid，VFAs）和乙醇，经2 000 r/min 离心10 min，取上清液每天加入285.7 mL至2.5 L 厌氧发酵罐。厌氧发酵罐中接种体积比20%猪粪发酵沼液作为接种物，接种物中微生物通过16S rDNA 高通量测序，细菌以Clostridium、Terrisporobacter和Turicibacter为主，产甲烷菌以Methanosarcina和Methanobrevibacter为主。在预处理产酸阶段，以单独的蛋白胨纤维素培养基作为试验的对照组，记为CK，在厌氧发酵产甲烷阶段，以未添加复合菌的处理为对照组，记为CK，每组试验设3 个重复。

1.3 试验装置

稻秆生物预处理厌氧发酵装置如图1 所示。试验用1 L 的产酸发酵罐和2.5 L 的厌氧发酵罐，2 个发酵罐的瓶口都使用带有玻璃导管的橡胶塞进行密封，采用水浴加热，自动控制发酵温度，进行为期40 d 的中温（35±1）℃厌氧发酵，用集气袋收集气体，酸化并离心好的料液，在蠕动泵的作用下按照产甲烷相水力停留时间（Hydraulic Retention Time，HRT）7 d 定量输送到厌氧发酵罐中产沼气。

图1 试验示意图 Fig.1 Schematic diagram of the experiment

1.4 分析方法

测定稻秆降解率时采用滤网过滤产酸发酵液，将残留物85 ℃烘干称质量，用减质量法计算出稻秆降解率[8]，纤维素、半纤维素和木质素的测定采用全自动纤维素测定仪（ANKOM2000i），pH 值采用pH 计（PB-10）测定，sCOD 采用COD 测定仪（DR1010）测定，产气量用排水法测定，甲烷含量和VFAs 浓度采用气相色谱仪（GC-2030）进行测定。稻秆组分、VFAs、pH 值和sCOD 每3 d 测定一次，产气量和甲烷含量每天测定一次。

1.5 16S rDNA 高通量测序和宏基因组测序

将样品10 000 r/min 离心5 min，弃上清液，剩余沉淀物按照试剂盒（FastPrep® Kits）说明书进行DNA提取，将检测合格的DNA 样品，选用细菌通用性引物 338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和 806R （GGACTACHVGGGTWTCTAAT）进行PCR 扩增，16S rDNA 高通量测序。同时，对第3 天的发酵样品用E.Z.N.A.® Kits 试剂盒进行DNA 抽提，通过Covaris M220将抽提到的DNA 进行片段化，筛选其中约300 bp 的片段进行PE 文库的构建和宏基因组测序。高通量测序和宏基因组测序数据均使用上海美吉生工云平台进行分析（https：//i-sanger.com）。

2 结果与分析

2.1 复合菌系预处理稻秆对稻秆组分和VFAs、乙醇的影响

复合菌系预处理中，稻秆及其各组分的变化如图2所示。由图2a 可以看出，复合菌系预处理稻秆的前3 d，稻秆的降解速度最快，在第3 天时，稻秆的降解率达到64.05%，纤维素和半纤维素的降解率分别达到61.02%和76.81%，最难降解的木质素，降解率也达到了20.31%，这比宋亚彬等筛选的复合菌系BYND-8，在稻秆达到相似降解率时的时间缩短了4 d[15]，此时，由于复合菌系对稻秆的降解，其致密结构被打破，稻秆的结构呈现松软、蓬松状态，其烘干后的表观状态呈现出多于第1 天的情况（图2b）；复合菌系预处理稻秆6 d 后，纤维素和半纤维素降解速度减慢，稻秆的降解率也增加缓慢，到12 d时，大部分稻秆被复合菌系降解（图2b），稻秆的降解率达到89.02%，是Wang 等筛选的复合菌系XDC-2 的2倍[16]，纤维素和半纤维素降解率分别达到80.51%和88.73%，木质素的降解率也到达了62.68%，这表明复合菌系具有强大的木质纤维素降解能力。

图2 复合菌预处理稻秆时各组分的变化及降解效果 Fig.2 Components variation and degradation effect of rice straw bio-pretreated by microbial consortium

复合菌系预处理稻秆2 d，由于VFAs含量增加，pH值由9.0迅速降至6.2，第5天后，由于VFAs中乙酸、丁酸和戊酸含量逐渐降低，加之培养基中蛋白质的分解，使得pH值逐渐增加，在第7天达到7.5左右（图3a）；而培养基中由于葡萄糖分解产生VFAs，使得pH值在前2 d由9.0降至7.0，随后由于VFAs含量的降低和蛋白质的分解，使得pH值在2 d后稍有增加，在第7天时达到8.0左右（图3b），这意味着该复合菌系具有一定的pH值调节能力。

图3 复合菌预处理稻秆时pH 值、VFAs（Volatile Fatty Acids）的变化 Fig.3 pH value, VFAs concentration of bio-pretreated rice by microbial consortium

图3 a 显示，复合菌预处理稻秆过程中，乙酸在第1天就处于较高浓度，达到1 779.3 mg/L，并在第3 天达到最高值2 278.36 mg/L，随后乙酸含量虽稍有下降，但始终保持在较高的浓度（1 400 mg/L 以上），远高于对照组第2 天乙酸含量的最高值421.34 mg/L（图3b）；丁酸和乙醇在稻秆生物预处理的初期，浓度都较低，随着复合菌对稻秆预处理时间由1 d 增加到6 d，丁酸含量由423.76 mg/L 增加到1 485.89 mg/L，乙醇含量也由第1 天时的97.31 mg/L 增加到第5 天时的1 642.61 mg/L，随后，这两者的含量都开始逐渐降低，至第7 天时，丁酸和乙醇含量分别降至1 325.54 mg/L 和1 097.19 mg/L（图3a），远高于对照组丁酸在第2 天的最高值166.19 mg/L 和乙醇第1 天的最高值15.60 mg/L（图3b）。本研究筛选的复合菌系，其乙酸（2 278.36 mg/L）和丁酸含量（1 485.89 mg/L）远高于目前文献报道的乙酸（1.5 g/L）和丁酸（0.6 g/L）浓度[17]，而且，复合菌预处理稻秆7 d，乙酸含量占总VFAs 的54.51%，丁酸含量占总VFAs 的29.02%，而丙酸和戊酸在整个稻秆生物预处理阶段都保持较低的含量，仅占VFAs 的12.89%和3.58%。这说明复合菌系预处理稻秆是以乙酸和丁酸为主的丁酸型发酵。

2.2 复合菌系预处理稻秆的菌群结构及功能解析

由图2 可知，复合菌系预处理稻秆的前3 d，稻秆的降解速度最快，已被产甲烷菌利用的乙酸也在第3 天达到最高值，故选择第1 天和第3 天的微生物菌群进行分析，结果如图4 所示。图4 显示，复合菌系预处理稻秆过程中，微生物在属水平上第1 天和第3 天的优势菌属差异不大，主要为Cellulosilyticum、Prevotella、Pseudomonas、Mobilitalea、Lysinibacillus、Clostridium和Oscillibacter等；但第1 天和第3 天，各菌属的相对丰度差异极显著（P<0.001）。

图4 复合菌系预处理稻秆第1 天和第3 天菌群在属水平上的分类及显著性分析（P<0.01） Fig.4 Classification and the significant difference analysis of 1d and 3d microbial consortium at genus level during rice straw bio-pretreated（P<0.01）

由于稻秆的主要成分为碳水化合物，通过物种（属水平）与功能贡献度分析发现，各菌属都对碳代谢有最高的贡献度，相对贡献度均在45%以上，Lysinibacillus的相对贡献度甚至达到了65.11%（图5）。稻秆是由纤维素、半纤维素和木质素组成的复杂交联结构，其中，纤维素是由D-葡萄糖通过β-1，4 糖苷键链接而成的长链高分聚合物[18]，半纤维素是由几种不同类型的单糖（葡萄糖、木糖、甘聚糖、阿拉伯糖与半乳糖等）构成的异质多聚体[19]。在复合菌中，相对丰度在前 3 位的Cellulosilyticum、Prevotella和Pseudomonas都对糖酵解有非常高的相对贡献度，分别达到了25.91%、21.99%和17.65%，其中，Prevotella对果糖、甘露糖代谢有最大的相对贡献度，达到20.90%，而Cellulosilyticum对戊糖转化具有最大的贡献度，达到了11.98%（图5），这意味着Cellulosilyticum和Prevotella都对纤维素和半纤维素有非常强的代谢能力。有研究表明，Cellulosilyticum和Prevotella可以将纤维素、纤维二糖、木聚糖和葡萄糖等降解转化为以甲酸、乙酸为主的代谢产物[20-22]，而复合菌系中相对丰度前10 位的Mobilitalea、Clostridium和Ruminococcaceae，也能将纤维素、半纤维素和纤维二糖转化为以乙酸、乙醇、丁酸等为主的代谢产物[23-24]，这使得本复合菌系在生物预处理稻秆初期，乙酸和丁酸就达到较高的浓度。木质素是复杂的芳香族多聚物，它通常是稻秆中最不易降解的组分。在复合菌相对丰度前三位的菌属中，Pseudomonas对芳香族化合物的降解有最大的相对贡献度，达到7.5%（图5），这使得本复合菌系在生物预处理稻秆初期，就对稻秆有非常强的降解能力。

图5 复合菌系的物种和功能贡献度分析 Fig.5 Species and functional contribution analysis of microbial consortium

2.3 复合菌系预处理对稻秆厌氧发酵的影响

复合菌系预处理稻秆中，第3 天的乙酸含量最高，由于厌氧发酵中，70%～80%的甲烷来自于乙酸的转化[13]，所以将稻秆生物预处理第3 天的酸液通过半连续方式进行厌氧发酵，结果如图6 和图7。由图6 可知，在整个厌氧发酵过程中，试验组的sCOD 和VFAs 浓度都远高于对照。由于厌氧微生物需适应接种的发酵环境，这使得sCOD、VFAs 和乙酸的含量在发酵的前几天都在逐渐增加，试验组VFAs 和乙酸浓度在第6 天达到稳定，sCOD在第15 天达到稳定，而对照组的sCOD、VFAs 和乙酸含量均在第15 天达到稳定。无论试验组还是对照，在整个40 d 的厌氧发酵中，丙酸、丁酸和戊酸的浓度几乎保持不变。 属Geobacter，但Methanosarcina 或Methanosarcina 有可能和其他菌互营降解乙醇和丁酸产甲烷，这使得厌氧发酵在进入稳定期后，虽然试验组和对照组的日产气量相差不大，但试验组的甲烷含量和日甲烷产量都高于对照组。在第40 天的厌氧发酵中，试验组的日甲烷产量始终保持在200 mL/d 左右，日产气量、甲烷含量和日甲烷产量较对照分别增加了11.34%、25.24%和34.10%。

图6 厌氧发酵中的VFAs 和sCOD 浓度变化 Fig.6 Variation of VFAs and sCOD concentration in anaerobic fermentation

图7 厌氧发酵中的日产气量、甲烷产量和甲烷含量 Fig.7 Daily biogas yield, methane yield and methane content in anaerobic fermentation

由于乙酸是产甲烷菌最易利用的底物，这使得厌氧发酵初期，试验组的日产气量、甲烷含量和日甲烷产量就远高于对照，厌氧发酵前6 d，试验组的平均日产气量、甲烷含量和日甲烷产量分别较对照组增加了17.7%、68.9%和72.58%。在厌氧发酵中，始终未检测到产酸阶段出现的乙醇，根据Rotaru 等的研究，甲烷八叠球菌Methanosarcina barkeri可与G. metallireducens通过直接种间电子转移（Direct Interspecies Electron Transfer，DIET）互营降解乙醇产甲烷[25]，而且，乙醇也能促进地杆菌属Geobacter和甲烷丝菌属Methanosaeta或甲烷八叠球菌属Methanosarcina对丙酸和丁酸的互营降解[26]，在厌氧发酵中，丁酸含量由产酸阶段第3 天的862.02 mg/L降至厌氧发酵阶段的250 mg/L 左右，虽然在复合菌系和厌氧发酵接种物中均未发现G. metallireducens和地杆菌

3 结 论

1）复合菌系对稻秆进行预处理，稻秆的降解主要发生在前3 d，其降解率达到64.05%。复合菌系预处理稻秆12 d，稻秆的降解率达到89.02%，半纤维素、纤维素和木质素的降解率分别达到88.73%、80.51%和62.68%。

2）复合菌系预处理稻秆的代谢产物以乙酸和丁酸为主，乙酸和丁酸含量分别占总VFAs 的54.51%和29.02%，最高乙酸和丁酸含量分别达到 2 278.36 mg/L 和1 485.89 mg/L。

3）复合菌系主要由Cellulosilyticum、Prevotella、Pseudomonas、Mobilitalea、Lysinibacillus、Clostridium和Oscillibacter等组成，它们对碳代谢的相对贡献度均在45%以上，其中，Prevotella和Cellulosilyticum对果糖、甘露糖代谢和戊糖转化的相对贡献度最大，达到20.90%和11.98%，Pseudomonas对木质素降解的相对贡献度最大，达到7.5%。

4）复合菌系预处理稻秆半连续厌氧发酵产沼气，日产气量、甲烷含量和日甲烷产量分别较对照增加11.34%、25.24%和 34.10%，日甲烷产量始终保持在200 mL/d 左右。