低温等离子快速提高糖基化花生分离蛋白溶解性及乳化性

季 慧

（临沂大学生命科学学院，临沂 276000）

0 引 言

花生蛋白因其功能性质较差，严重阻碍了花生蛋白在食品工业中的应用。国内外科学家研究多种方法对花生蛋白进行改性以提高其功能性质，包括酶解、高压处理、超声波处理和微波处理。但这些方法存在耗时长、副产物产生周期短、效果有限、对环境造成污染、容易引起安全隐患等缺点。蛋白质和多糖的共价交联（糖基化）作为一种安全、无健康危害的蛋白改性方法，近年来，越来越受到科学家的关注。蛋白糖基化是指蛋白和多糖通过美拉德反应形成共价键[1]，研究表明，蛋白质糖基化可以改变蛋白质的溶解度、热稳定性、乳化性、界面性质、抗菌活性、胶凝性能、蛋白质的三级和二级结构[2-6]。其反应实质为蛋白质的ε-NH2与多糖分子上的还原末端羰基之间的反应。蛋白质与糖接枝改性一般分为湿热法和干热法两种，但是，两种方法反应时间较长，特别是干法反应，少则数十小时，多则几天甚至几周，传统湿热反应需要24 h 以上，能耗较高，不利于商品的产业化[5-7]。因此，寻求一种加速花生蛋白质与多糖的接枝技术与方法是提高花生蛋白应用于食品工业生产的关键问题。

低温等离子体（Non-Thermal Plasma，NTP）是一种新兴的、快速的、非热的、无害的技术，它由大量高能电子和活性自由基组成，包括原子氧（O）、超氧化物（O2•-）、一氧化氮（·NO）、羟基自由基（·OH）等，这些粒子结合在一起可以打破共价键，引发各种化学反应。NTP 越来越受到人们的关注，已被应用于修饰表面生物大分子，包括乳清蛋白、小麦粉、玉米蛋白、大米蛋白、肌原纤维蛋白、花生蛋白等[8-13]。结果表明NTP可以在几分钟内改变蛋白质的三级和二级结构，蛋白结构变松散，进而影响蛋白质的理化和功能特性。还有一些研究结果表明，蛋白质的糖基化与蛋白质三级结构的破坏程度密切相关[14-15]。等离子产生的高能粒子通过能量传质于蛋白表面，使其产生刻蚀作用，引发蛋白表面的化学键断裂，降低蛋白表面自由能，为蛋白表面的接枝反应提供大量的接枝位点，同时等离子产生的活性自由基也能引发单体的接枝聚合，能够对材料表面进行持久改性，有研究表明，等离子体已经成功应用于高分子材料表面接枝[16-18]。这些研究成果为蛋白-多糖接枝反应提供理论基础。

针对前人的研究结果中花生分离蛋白-葡聚糖反应条件复杂，接枝时间长，难于应用于实际生产中的特点，本研究采用低温等离子处理花生分离蛋白-葡聚糖混合溶液，旨在探索蛋白-多糖的快速糖基化反应方法，评价不同NTP 处理时间对花生蛋白分离-葡聚糖（Peanut Protein Isolate-Dextran，PPI-Dex）偶联物结构和理化性质的影响。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE）、傅里叶变换红外光谱（Fourier Transform Infrared，FTIR）、自动氨基酸分析仪、荧光分析仪、Turbiscan 等仪器表征和分析PPI-Dex 偶联物的分子量、二级结构和热稳定性、溶解性及稳定性等的变化。研究的结果可为蛋白质糖基化反应提供一种快速、安全、方便的技术，同时为制备高亲水性食品配料提供一种新的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

花生分离蛋白（Peanut Protein Isolate，PPI）是实验室采用碱溶酸沉法从低温脱脂花生蛋白粉中提取，PPI 粉中蛋白质质量分数为83.0%（湿基，凯氏常数：5.46）、脂肪1.56%、总糖5.67%、水分7.92%、 灰分1.85%。血清白蛋白购买于华美生物工程有限公司。赖氨酸、o-邻苯二甲醛（OPA）、β-巯基乙醇、二硫代二硝基苯甲酸、三羟甲基氨基甲烷等试剂均为分析纯级。

1.2 仪器与设备

DBD-50 低温等离子体设备，南京苏曼等离子科技有限公司；Ultra-Turrax T25 高速乳化剪切机，德国IKA 公司；E-201-C-9 紫外分光光度计，上海罗素科技有限公司；DY-6C 电泳仪，北京六一仪器厂；NicoletiS50 傅立叶变换红外光谱，美国赛飞世尔科技有限公司；F-4500 荧光分光光度计，日本HITACHI 公司；日立L-8900 全自动氨基酸分析仪；DSC-60A 差示扫描量热仪，日本SHIMADZU 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 共价交联产物的制备

用0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Solution，PBS）（pH 值=7.0）配成1 g/mL 的PPI-Dex（PPI：Dex=1∶1，体积比）溶液，充分溶解混合后，10 000 r/min，1 min 剪切，同时参照Li 等[19]研究结果将溶液加热至60 ℃，取10 mL PPI-Dex 溶液放入介质阻挡DBD-50 反应器中处理，输入电压为35 V，不断调节电流使其稳定在（2±0.02）A，即处理功率为70 W，处理时间为0、0.5、1.5、2.0、3.0 min；处理后的样品，于4 ℃透析24 h后真空冷冻干燥 (干燥室真空度0.09 MPa，温度-40 ℃)，得到PPI-Dex 交联物，备用。

1.3.2 接枝度测定

采用OPA 法测定糖基化反应的接枝度。参照Vigo等[20]和Chen 等[5]的方法制备试剂及步骤，以赖氨酸为标准物，利用下列公式（1）计算接枝度（Degree of Graft，DG）

式中A0为PPI-Dex 混合物中游离氨基酸的浓度，mmol/L；At为PPI-Dex 接枝物中游离氨基酸的浓度，mmol/L；A1：PPI 中游离氨基酸的浓度，mmol/L。

1.3.3 溶解度测定

采用双缩脲法测定蛋白含量[21]，取1.00 g 低温等离子处理后的PPI-Dex 交联物溶于100 mL 0.1 mol/L 的PBS （pH 值=7）中充分溶解后，于3 000 r/min 下离心15 min（备用）。取1 mL 上清液加入4 mL 双缩脲试剂，旋涡充分混合。反应30 min 后，在540 nm 下测定溶液的吸光度，不添加样品为空白。

1.3.4 溶液稳定性测定

用0.1 mol/L的PBS缓冲液（pH值7.0）配制成20 mg/mL的PPI-Dex 溶液，使溶液与大豆油以2∶3 的体积比混合后，以10 000 r/min 转速，均质2 min 得到PPI-Dex 乳状液。采用分散稳定性分析仪对花生分离蛋白的乳状液的稳定性进行分析，在室温（25 ℃）下每0.5 h 扫描1 次，连续扫描6 h。乳液稳定性指数（Turbiscan Stability Index，TSI）按公式（2）计算

式中Xi为每分钟测量的样本背向散射，XBS为Xi的均值，n 为扫描次数。

1.3.5 氨基酸测定

样品处理：取0.200 0 g NTP处理前后的样品于20 mL水解管中，加入6 mol/L 浓盐酸10 mL、，真空脱气10 min，充氮封管，在110 ℃下水解22 h。取出冷却后用去离子水无损转移到50 mL 的容量瓶中定容。准确取1 mL 水解液于蒸馏瓶中，于真空旋转蒸发仪水浴脱酸抽干（水浴温度40 ℃，真空度0.01 MPa），加1 mL 水再抽干，然后加入10 mL，0.02 mol/L 盐酸充分溶解，备用。样品过0.22 μm 的水相滤膜后上机分析[22]。

1.3.6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

采用还原型聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE）方法鉴定低温等离子处理前后花生蛋白中亚基的变化情况[23]。分离胶和浓缩胶的质量分数分别为12%和5%，样品中加入1 mmol/L β-巯基乙醇。电泳后，蛋白胶用考马斯亮蓝R250 染色。

1.3.7 热稳定性测定

称取粉末状样品3～5 mg 放置在坩埚中，压样密封，以空坩埚作为空白对照，放入差示扫描量热仪中测量，扫描范围为30～180 ℃，升温速度为5 ℃/min。并采用TA-60WS 软件计算样品的变性温度（Td）和焓变（∆H）。

1.3.8 傅里叶红外光谱（Fourier Transform Infrared，FTIR）测定

采用溴化钾压片法对样品进行红外光谱扫描。准确称量1 mg 花生蛋白样品，与150 mg 溴化钾混合均匀，用研钵研磨成均匀粉末，利用压片机将混合物压成薄片。采用傅里叶红外光谱仪对花生蛋白样品进行全波段扫描，扫描波长为4 000～400 cm-1，分辨率为4 cm-1，扫描次数为32[24]。

1.3.9 表面疏水性（Surface Hydrophobicity Index，H0）的测定

采用 1-苯胺基-8-萘磺酸（1-anilinonaphthalene-8- sulfonic acid，ANS）荧光探针法[25]，用 0.01 mol/L 的磷酸盐缓冲液（pH 值=7.0）配制不同质量分数的样品蛋白溶液（0.005%～0.2%）和8 mmol/L 的ANS 溶液。取20 μL ANS 溶液加到4 mL 蛋白溶液中，混合均匀，迅速测定混合液的荧光强度，激发波长和发射波长分别为390 和470 nm，以荧光强度对蛋白质浓度作图，直线斜率即为蛋白质样品的表面疏水性指数（H0）。

1.4 数据处理

采用SPSS 统计软件（Version 19.0，SPSS Inc.，Chicago，IL，USA），通过单因素方差分析（ANOVA）进行低温等离子处理对花生分离蛋白-葡聚糖交联物特性的显著性检验，P<0.05 认为有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 接枝度和溶解度分析

在加热60 ℃的情况下，采用NTP 对PPI-Dex 混合物进行短时接枝处理，结果如表1 所示，从表看出，随着NTP 处理时间的延长，PPI-Dex 接枝物的接枝度呈现先升高后略有下降的趋势，在处理1.5 min 时，接枝度达最大为21.62%，与超声波接枝PPI-Dex 需要40 min，传统湿接枝需要24 h 相比[7]，大大缩短了接枝时间。1.5 min 后，接枝度下降，其原因可能是由于高能粒子的持续轰击，部分形成的糖苷键再次断开，同时，由于高能粒子的活性物质氧化，使PPI 分子之间发生氧化聚合，导致PPI-Dex，PPI-PPI 发生竞争结合，故接枝度下降。

蛋白质的溶解度是影响其功能性质的重要因素，由表1 可以看出，随着NTP 处理时间的延长，蛋白溶解度呈现与接枝度相似的变化趋势，在1.5 min 时，PPI 溶解度最高为4.17 mg/mL，与未处理样品相比，PPI 溶解度提高了22.28 %，说明PPI 糖基化形成偶联物后，提高了蛋白的溶解性。这种现象可能是由于PPI-Dex 偶联物多糖的多羟基结构和Dextan 的立体效应增强了蛋白质与水分子之间的亲和力[14]。同时，NTP 处理诱导蛋白结构被打开，包埋在蛋白分子内部的亲水氨基酸残基暴露，促使蛋白的亲水性增加，溶解度升高。NTP 处理1.5 min 后，溶解度下降的原因可能是由于高能粒子的活性物质的氧化，蛋白因交联而聚集沉淀，PPI 溶解度降低。

表1 不同NTP 处理时间对PPI-Dex 接枝物接枝度和溶解度的影响 Table 1 Effects of different NTP treatment time on Degree of Graft (DG) and solubility of PPI-dextran conjugates

2.2 乳液稳定性分析

图1 显示了不同等离子处理时间对PPI-Dex 接枝物乳液稳定性（TSI）的影响，TSI 值越小，溶液乳化稳定性越高。由图1 可以看出，随着贮藏时间的延长，乳状液体系的TSI值均发生不同程度的增大。在贮藏时间0.5 h 内，等离子处理的样品的TSI 值均低于未处理样品，说明NTP 处理提高了PPI-DEX 接枝物的乳化活性。并且随着等离子处理时间的延长，TSI 值逐渐降低，在NTP 处理1.5 min 时，TSI 值达最低为3.54，与未处理样品5.18 相比，降低了31.67%。同时，随着贮藏时间的延长，样品的TSI 值均有不同程度的升高。等离子处理1.5 min 的样品的TSI 值与其他样品的TSI 值相比，均最低，说明DG 值越高，PPI-Dex 的乳化稳定性高。

图1 PPI-Dex 接枝物乳状液的稳定性指数（TSI） Fig.1 Turbiscan Stability Index (TSI) of PPI-dextran conjugates emulsions

2.3 SDS-PAGE 分析

PPI-Dex 接枝产物的SDS-PAGE 如图2 所示。由图2可以看出，在60 ℃条件下，NTP 处理后PPI-Dex 接枝物发生糖基化反应后，在分离胶上端有较宽条带出现，说明PPI-Dex 结合形成了分子量较大的糖蛋白复合物；NTP处理较短时间就发生糖基化反应，糖基化反应发生后，伴花生球蛋白Ⅱ（＞61.0 kDa）、酸性花生球蛋白（40.5、37.5、35.5 kDa）的条带颜色变浅、减少。此现象说明，在反应液60 ℃条件，NTP 处理能够协同PPI 与Dex 发生共价接枝反应。

图2 不同NTP 处理时间下PPI-Dex 接枝物的SDS-PAGE 图 Fig.2 SDS-PAGE of PPI-dextran conjugates treated by different NTP time

2.4 氨基酸分析

表2 列举了在加热60 ℃条件下，NTP 处理对PPI-Dex接枝物中氨基酸变化影响，由表2 可以看出，在60 ℃条件下，NTP 处理PPI-Dex 接枝物后，苯丙氨酸（Phe）和赖氨酸（Lys）相对含量显著降低，说明等离子处理引起的蛋白的反应位点可能主要是Phe 和Lys，在一些报道中蛋白质发生糖基化时Lys 和Arg（精氨酸）相对含量明显降低[26-27]，而等离子处理后PPI 中Arg 的相对含量没有降低，原因可能是由于等离子主要是表面处理，而Arg在PPI 表面分布较少的原因所致。

2.5 DSC 分析

表3 列举了不同NTP 处理后PPI-DEX 接枝物的热力学参数的变化，变性温度（Td）反映了蛋白的热稳定性和聚集程度，焓值（ΔH）与蛋白的疏水相互作用有关[23]。从表3 可以看出，随着NTP 处理PPI-Dex 接枝物时间的延长，Td值、ΔH 呈先降低后增加的趋势，表明NTP 处理后，PPI 的热稳定性降低，分子间作用力减弱，PPI 聚集程度降低，活性基团被暴露，为PPI 与Dex 接枝提供反应位点。同时，由于Dex 分子含有大量羟基，亲水性强，随着接枝度增加，引入蛋白的羟基增多，PPI-Dex 接枝物的疏水作用减弱，亲水作用增强，与表1 中的溶解度结果一致；处理2 min 后，随着高能粒子的持续轰击，蛋白之间发生交联，分子聚集程度增加，Td值增加；同时，亲水基团被包埋，ΔH 增加，亲水作用减弱，疏水作用增强。

表3 PPI-Dex 接枝物的热力学参数 Table 3 Thermodynamic parameters of PPI-dextran conjugates

2.6 FTIR 分析

如图3 展示了NTP 处理后PPI-Dex 接枝物的图谱变化。一般来说，蛋白与糖共价结合后，典型的特征是羟基的增加，在红外图谱上一般表现在3 000～3 500 cm-1及1 000～1 260 cm-1处出现吸收[28]。随着NTP 处理时间的延长，3 500～3 000 cm-1及1 260～1 000 cm-1处峰的吸收值逐渐增加，在处理1.5 min 时吸收峰值达最大，说明在此条件下，引入蛋白的羟基最多，PPI-Dex 接枝程度最大，该结果与表1 中处理1.5 min 时，PPI-Dex 接枝物的接枝度（DG）最大的结果相一致，同时，糖基化反应后，PPI 在1 537 和1 654 cm-1处的峰（未处理）偏移到1 539和1 656 cm-1处（1.5 min）（图4），表明美拉德反应导致了Schiff 碱基的形成[29]，进一步证实了PPI 与Dex 以共价键的形式相结合。

图3 NTP 处理对PPI-Dex 接枝物的红外光谱影响 Fig.3 Effect of NTP treatment on FTIR of PPI-Dex conjugates

图4 NTP 处理1.5 min 与未处理时PPI-Dex FTIR 光谱图变化比较 Fig.4 Comparison of FTIR spectra of untreated PPI-Dex mixture and the PPI-Dex conjugate treated by NTP for 1.5 min

酰胺I 带对蛋白质的二级结构相当敏感，选取红外光谱中的酰胺Ⅰ带（1 600～1 700 cm-1）进行分析，用Omnic 软件用对蛋白质各二级结构进行定量分析。对应于二级结构的谱带如下：1 650～1 670 cm-1对应于α-螺旋，1 610～1 640 cm-1对应于β-折叠，1 660～1 700 cm-1对应于β-转角，1 640～1 650 cm-1对应于无规则卷曲。每个二级结构组分的百分比通过相应峰的面积来计算[30]。NTP 处理后PPI 二级结构变化结果如表4，由表中看出，NTP 处理0.5 min 与未处理相比，β-折叠含量增加，β-转角含量降低，一般来说，β-折叠较稳定，表面疏水；β-转角在蛋白的表面，表面亲水[31-32]，结果表明，NTP 处理0.5 min 时，PPI 表面疏水性增强。随着处理时间的延长，β-折叠、α-螺旋相对百分含量降低，无规则卷曲百分含量稍有下降，β-转角含量增加；在1.5 min 时，β-折叠和α-螺旋含量最低，β-转角含量最高。说明蛋白的有序结构被破坏，结构变松散，蛋白表面由疏水型向亲水型转变。

表4 不同NTP 处理时间对PPI 二级结构的影响 Table 4 Effects of different NTP treatment time on secondary structure composition of PPI

2.7 蛋白表面疏水性分析

NTP处理前后PPI-Dex接枝物表面疏水性结果如图5所示，Ho代表蛋白质表面与极性水环境接触的疏水基团数量，Ho值越大，表明蛋白疏水性越强。有研究表明，疏水基团大部分隐藏于球蛋白质的内部区域[33]。等离子处理后，蛋白周围结构变松散，埋藏在内部的疏水基团被暴露，蛋白表面疏水性增加，在处理0.5 min 时，蛋白表面疏水性高于未处理样品，随着NTP 处理时间的延长，接枝度增加，Dex 被引入的越来越多，由于Dex 分子包含的羟基多，亲水强，蛋白表面亲水基团增加，疏水基团被包埋，荧光探针ANS 无法与其结合，PPI 的 Ho降低，表面疏水性减弱。在处理1.5 min 时，接枝度最大，此时PPI 表面疏水性达最低，从4 839.3（0 min）降低到3 951.4（1.5 min），降低了30.86%。花生蛋白表面疏水性的逐渐降低揭示了花生蛋白分子间疏水性相互作用的减少，亲水性相互作用的增加，使得花生蛋白溶液亲水性增加。处理1.5 min 后，随着等离子处理时间的延长，可能由于活性物质的氧化使蛋白分子之间发生氧化聚合，被暴露的ε-氨基含量减少，接枝位点减少，PPI-Dex 接枝物接枝度降低，结合到蛋白表面的Dex 减少，羟基减少，蛋白表面亲水性下降，表面疏水性增加，故Ho 值增加。

图5 不同NTP 处理时间对PPI-Dex 接枝物的疏水性指数（Ho）的影响 Fig.5 Effects of different NTP treatment time on surface hydrophobicity index (Ho) of PPI-dextran conjugates

3 结 论

低温等离子体（Non-Thermal Plasma，NTP）处理可明显加速蛋白质与多糖之间的糖基化反应。NTP 处理仅需1.5 min 即可达到21.62%的接枝度（Degree of Graft，DG），与超声接枝PPI-dextran 40 min、传统湿法接枝24 h 相比，NTP 缩短了接枝时间。具体结果为，在70 W 处理功率下，反应液温度加热到60 ℃，低温等离子放电时间为1.5 min时，PPI-Dex 接枝度和溶解度达到最大，与未接枝相比，溶解度提高了22.28%。同时，PPI-Dex 的乳化稳定性也得到提高，其TSI 值在贮藏时间为0.5 h 时，降低了31.67%。这是因为NTP 可以使PPI 的二级和三级结构展开，暴露PPI 的糖基化位点，赖氨酸和苯丙氨酸与葡聚糖接枝形成PPI-Dex偶联物，其偶联物由于多羟基的引入，表面疏水性降低。

在后续研究中，将继续对NTP 放电工艺参数进行优化，为制备高亲水PPI-Dex 偶联物提供技术支持，同时，为采用NTP 技术快速制备其他高亲水性蛋白食品配料提供理论参考。