穗花杉双黄酮对脂多糖致大鼠急性肺损伤的保护作用及机制研究

严双凤 徐志波

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）及其更严重形式呼吸窘迫综合征（ARDS）是重症患者死亡的主要原因[1]，ALI 的发生可以由许多因素触发，例如休克、败血症、创伤、烧伤、严重的肺炎和急性胰腺炎等。ALI 的发病机制特征是快速起效的肺水肿，低氧血症，肺泡—毛细血管屏障损伤，炎性细胞募集，不受控制的氧化应激和炎症过程[2]。研究表明，脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）诱导的急性炎症反应能明显促进ALI 的发生和发展[3]。传统中药卷柏具有抗癌、活血、抑菌、解痉的功效。穗花杉双黄酮是卷柏的乙酸乙酯提取物，此前已有报道穗花杉双黄酮具有抗氧化、降血糖、保护血管、抗炎及抗肿瘤等功效[4-6]。本研究探讨穗花杉双黄酮对LPS 诱导的大鼠ALI 的保护作用及机制。

1 实验材料

1.1 动 物 60 只雄性SD 大鼠（SPF 级），体质量（200±10）g，均购自上海吉辉实验动物饲养有限公司，实验动物生产许可证∶SCXK（沪）2017-0012，实验动物伦理批号∶2018154，实验动物合格证号∶SCXK（浙）2014-0001。实验期间，动物自由进食，光照12h。

1.2 细 胞 人肺上皮细胞系A549 购自美国标准生物品收藏中心（ATCC）。

1.3 药 物 穗花杉双黄酮（批号6284595）购自上海展舒化学科技有限公司；地塞米松磷酸钠注射液（批号000706）购自江苏涟水制药有限公司；LPS（批号1905073）购自大连美仑生物技术有限公司。

1.4 试剂及仪器 苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-Eosin staining，HE）染色试剂盒（批号20160122）购自北京索莱宝科技有限公司；大鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA 检测试剂盒（批号142073044）、大鼠白细胞介素-6（IL-6）ELISA 检测试剂盒（批号141702035）、大鼠白细胞介素-1β（IL-1β）ELISA 检测试剂盒（批号145535023）均购自美国赛默飞世尔；微小RNA 140-5p（miR-140-5p）mimic 及mimic-NC（批号G394885）、microRNA 转染试剂盒（批号9897834）购自上海吉玛制药技术有限公司；Toll 样受体4（TLR4）兔单抗（批号T9385）、核因子活化B 细胞κ 轻链增强子（NF-κB）兔单抗（批号943859）购自美国abcam 公司，Actin 鼠单抗（批号52545）购自武汉三鹰生物技术有限公司。奥豪斯电子天平SPX2201ZH 购自奥豪斯仪器（上海）有限公司；Pannoramic 切片扫描仪购自济南吉丹尔电子有限公司；PHERAstar FSX 多功能酶标仪购自美国Bio-Gene科技有限公司；ChemiDoc MP 扫膜仪、荧光定量PCR仪购自美国伯乐公司。

2 实验方法

2.1 大鼠ALI 模型的构建 将60 只SPF 级大鼠按照随机数字表法分为四组∶对照组、模型组、阳性对照组、穗花杉双黄酮组（简称穗花杉组），每组15 只。造模前12h 大鼠禁食，造模开始先用异戊巴比妥（30mg/kg）腹腔注射麻醉，模型组、阳性对照组和穗花杉组大鼠均通过气道滴注LPS（3.0mg/kg，100μL），对照组气道滴注等体积的生理盐水，6h 后阳性对照组大鼠腹腔注射地塞米松（2.5mg/kg，100μL），穗花杉组大鼠腹腔注射穗花杉双黄酮（2.5mg/kg，100μL），对照组和模型组注射等体积生理盐水，24h后出模。

2.2 大鼠肺组织石蜡切片HE 染色 大鼠肺组织取材后，利用10%多聚甲醛固定，经过脱水浸蜡包埋后制成石蜡切片，切片厚度为0.4μm。按照HE 染色试剂盒说明书操作进行染色，最后利用中性树脂分片，使用切片扫描仪扫描切片，选取HE 染色肺组织特征性区域展示。

2.3 ELISA 法检测大鼠血清TNF-α、IL-6 和IL-1β水平 分离出各组大鼠血清后，按照ELISA 检测试剂盒检测血清TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平。每只大鼠血清样3 个复孔，使用多功能酶标仪测定450nm出吸光度值，每只大鼠3 个复孔取平均值。

2.4 WB 检测大鼠肺组织TLR4、NF-κB 蛋白水平肺组织部分剪碎后加入蛋白裂解液，利用组织匀浆仪制备组织匀浆，放冰上裂解1h 后，离心取上清为蛋白样，利用BCA 法测定蛋白浓度后，加入loading使蛋白样终浓度为1μg/μL，蛋白跑胶上样20μg，经过电泳转膜封闭后，4℃孵育一抗过夜，洗去一抗后室温孵育化学发光二抗1h，使用ChemiDoc MP 扫膜仪分析结果。

2.5 细胞培养 人肺上皮细胞A549 采用含10%胎牛血清的高糖1640 完全培养基培养（含1%的青霉素-链霉素双抗）于37℃恒温培养箱中。细胞密度达到90%～95%时传代铺板。将肺上皮细胞系A549 铺板于6 孔板中，分四组∶刺激组、阳性对照组和穗花杉组加入100ng/mL 的LPS，同时阳性对照组加入地塞米松（100ng/mL），穗花杉组加入穗花杉双黄酮100ng/mL，对照组加入等体积生理盐水，处理4h 后提取RNA。对于miR-140-5p mimic 和mimic-NC 转染A549，按照吉玛基因microRNA 转染试剂盒说明书操作。转染24h 后，同样分为四组∶刺激组、miR-140-5p mimic 组、mimic-NC 组分别加入100ng/mL的LPS，对照组加入等体积生理盐水，刺激4h 后提取RNA。

2.6 RT-PCR 检测miR-140-5p、TLR4、NF-κB 表达将组织或者细胞RNA 提取后，逆转为cDNA 进行RT-PCR 检测，引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。引物如下∶miR-140-5p 引物∶forward 5-′TGCGGCAGTGGTTTTACCCTATG-3′，reverse 5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；TLR4 引 物∶forward 5-′CCTCGGCGGCAACTTCATAA-3′，reverse 5′-AGAGCGGATCTGGTTGTACTG-3′；NF-κB p65 引物∶forward 5-′ATCCCATCTTTGACAATCGTGC-3′，reverse 5′-5′-CTGGTCCCGTGAAATACACCTC-3′。反应程序∶94℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循环数35 个。3 次独立重复实验。

2.7 统计学方法 应用GraphPad Prism 5 软件进行统计分析，计量资料均采用均数±标准差（），多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t 检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组大鼠肺组织湿/干重比 与对照组比较，模型组大鼠肺组织湿/干重比明显增加（P＜0.05），提示模型构建成功。与模型组比较，穗花杉组、地塞米松处理阳性对照组大鼠肺组织湿/干重比明显降低（P＜0.05），穗花杉组与阳性对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

3.2 各组大鼠肺组织病理形态 对照组大鼠肺泡组织结构完整，无炎症浸润情况；模型组ALI 大鼠出现明显的炎性浸润，肺泡间隔增厚和间质水肿；与模型组ALI 大鼠比较，地塞米松处理阳性对照组ALI 大鼠肺部炎症明显减轻，肺泡间隔变薄；穗花杉组肺组织炎症细胞明显减少，肺泡间隔明显变薄。见插页图1。

表1 各组大鼠肺组织湿/干重比比较（）

表1 各组大鼠肺组织湿/干重比比较（）

注∶对照组给予生理盐水气道滴注+生理盐水腹腔注射；模型组给予LPS（3.0mg/kg，100μL）气道滴注+生理盐水腹腔注射；阳性对照组给予LPS（3.0mg/kg，100μL）气道滴注+地塞米松（2.5mg/kg，100μL）腹腔注射；穗花杉组给予LPS（3.0mg/kg，100μL）气道滴注+穗花杉双黄酮（2.5mg/kg，100μL）腹腔注射；LPS 为脂多糖；与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

3.3 各组大鼠血清TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平 与对照组比较，模型组ALI 大鼠血清TNF-α、IL-6 和IL-1β 表达水平明显升高（P 均＜0.05）；与模型组比较，穗花杉组和阳性对照组大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β 表达水平明显降低（P 均＜0.05），穗花杉组与阳性对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 各组大鼠血清TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平比较（pg/mg，）

表2 各组大鼠血清TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平比较（pg/mg，）

注∶对照组给予生理盐水气道滴注+生理盐水腹腔注射；模型组给予LPS（3.0mg/kg，100μL）气道滴注+生理盐水腹腔注射；阳性对照组给予LPS（3.0mg/kg，100μL）气道滴注+地塞米松（2.5mg/kg，100μL）腹腔注射；穗花杉组给予LPS（3.0mg/kg，100μL）气道滴注+穗花杉双黄酮（2.5mg/kg，100μL）腹腔注射；LPS 为脂多糖；TNF-α 为肿瘤坏死因子-α；IL-6 为白细胞介素-6；IL-1β 为白细胞介素-1β；与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

3.4 各组大鼠肺组织TLR4、NF-κB 蛋白表达水平模型组大鼠肺组织TLR4、NF-κB 蛋白水平明显高于对照组；穗花杉组和阳性对照组ALI 模型大鼠肺组织TLR4、NF-κB 明显低于模型组。穗花杉组与阳性对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见插页图2。

3.5 各组大鼠肺组织miR-140-5p 相对表达量 与对照组比较，模型组大鼠肺组织miR-140-5p 表达明显下调（P＜0.05）；与模型组比较，穗花杉组、阳性对照组大鼠肺组织miR-140-5p 表达明显上调（P＜0.05），穗花杉组与阳性对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

3.6 miR-140-5p 对人肺上皮细胞TLR4、NF-κB 表达的影响 与对照组比较，刺激组人肺上皮细胞miR-140-5p 表达明显下调（P＜0.05）；与刺激组比较，穗花杉组人肺上皮细胞miR-140-5p 表达明显上调（P＜0.05）。穗花杉组与阳性对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组比较，刺激组人肺上皮细胞TLR4、NF-κB 表达明显上调（P＜0.05）；与刺激组比较，miR-140-5p mimic 组TLR4、NF-κB 表达明显下调（P＜0.05）。见表4-5。

表3 各组大鼠肺组织miR-140-5p 相对表达量比较（）

表3 各组大鼠肺组织miR-140-5p 相对表达量比较（）

注∶对照组给予生理盐水气道滴注+生理盐水腹腔注射；模型组给予LPS（3.0mg/kg，100μL）气道滴注+生理盐水腹腔注射；阳性对照组给予LPS（3.0mg/kg，100μL）气道滴注+地塞米松（2.5mg/kg）腹腔注射；穗花杉组给予LPS（3.0mg/kg，100μL）气道滴注+穗花杉双黄酮（2.5mg/kg）腹腔注射；LPS 为脂多糖；与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

表4 各组人肺上皮细胞miR-140-5p 相对表达量比较（）

表4 各组人肺上皮细胞miR-140-5p 相对表达量比较（）

注∶对照组给予生理盐水刺激4h；刺激组给予LPS（100ng/mL）刺激4h；阳性对照组给予LPS（100ng/mL）+地塞米松（100ng/mL）刺激4h；穗花杉组给予LPS（100ng/mL）+穗花杉双黄酮（100ng/mL）刺激4h；LPS 为脂多糖；与对照组比较，aP＜0.05；与刺激组比较，bP＜0.05

表5 各组人肺上皮细胞TLR4、NF-κB 相对表达量比较（）

表5 各组人肺上皮细胞TLR4、NF-κB 相对表达量比较（）

注∶对照组给予生理盐水刺激4h；刺激组给予LPS（100ng/mL）刺激4h；miR-140-5p mimic 组给予预转染miR-140-5p mimic 24h+LPS（100ng/mL）刺激4h；mimic-NC 组给予预转染mimic-NC 24h+LPS（100ng/mL）刺激4h；TLR4 为Toll 样受体4；NF-κB 为核因子活化B细胞κ 轻链增强子；LPS 为脂多糖；与对照组比较，aP＜0.05；与刺激组比较，bP＜0.05

4 讨论

穗花杉双黄酮是深绿卷柏的乙酸乙酯提取物，此前多项研究发现，穗花杉双黄酮的抗肿瘤活性，能够有效抑制肿瘤生长、促进细胞凋亡和抑制肿瘤转移[7]。而其抗炎活性报道较少，Pan 等[8]发现穗花杉双黄酮通过抑制ERK 信号活化，从而抑制NF-κB 的活化。本研究也发现，穗花杉双黄酮能够抑制TLR4/NF-κB 信号，从而抑制ALI 炎症反应。

LPS 进入肺部组织后与其主要受体TLR4 结合，促进NF-κB 介导的炎症基因的表达，如TNF-α、IL-6 和IL-1β 等[9-10]。Wang 等[11]研究发现，抑制TLR4/NF-κB 能够显著减轻LPS 诱导的大鼠ALI 症状。基于此，本研究对大鼠ALI 肺组织内TNF-α、IL-6 和IL-1β 炎症因子表达及TLR4、NF-κB 蛋白进行检测，发现穗花杉双黄酮能明显抑制TNF-α、IL-6 和IL-1β 等炎症因子的表达（P＜0.05），同时WB 结果显示，穗花杉双黄酮明显抑制TLR4、NF-κB 蛋白水平。

文献报道，microRNA 在肺部炎症中参与药物治疗的过程[12-13]，动物实验发现，miR-140-5p 通过靶向TLR4/NF-κB 参与调控LPS 诱导小鼠ALI 的肺部炎症的发生[14]。因此推测穗花杉双黄酮是否通过miR-140-5p 影响TLR4/NF-κB 的表达，从而缓解肺部急性炎症反应。本实验结果显示，穗花杉双黄酮组大鼠肺部miR-140-5p mimic 表达明显高于模型组（P＜0.05），同时RT-PCR 结果发现过表达miR-140-5p mimic 能明显抑制LPS 诱导的TLR4/NF-κB 表达上调（P＜0.05）。因此穗花杉双黄酮可能通过抑制LPS作用下miR-140-5p mimic 下调，从而降低TLR4/NF-κB 的表达。

综上所述，本研究发现穗花杉双黄酮能够促进miR-140-5p mimic 表达，抑制ALI 炎症过程中关键蛋白TLR4/NF-κB 表达以及其下游炎症因子TNFα、IL-6 和IL-1β 的生成，明显减轻LPS 诱导的大鼠ALI。