肝爽颗粒对新型组织工程肝脏非酒精性脂肪性肝病大鼠模型脂代谢的影响

张译之，段钟平，张晓慧，陈 煜

首都医科大学附属北京佑安医院 疑难肝病及人工肝中心，肝衰竭与人工肝治疗研究北京市重点实验室，北京 100069

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种无过量饮酒史、以肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征、与胰岛素抵抗(IR)密切相关的临床病理综合征[1]。目前 NAFLD 已经成为全球最主要的慢性肝病，2016年全球平均患病率为24%，其中亚洲患病率为27%[2-3]。NAFLD过去被认为主要发生在西方发达国家，然而，近20年来随着亚洲地区人民生活水平的提高，NAFLD在亚洲地区的患病率逐年升高[4]。因此，探索NAFLD发病的机制，发现潜在的干预靶点是亟待解决的问题。目前尚无针对NAFLD的特异性药物，传统的他汀类、双胍类及血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂等仅作为NAFLD降脂、改善胰岛素抵抗及合并高血压时的治疗；法尼醇受体激动剂具有潜在的调节脂代谢的作用，但由于副作用明显，尚不推荐用于NAFLD的治疗，因此，中药在改善NAFLD的作用方面受到越来越多的关注[5-6]。

肝爽颗粒(Ganshuang granule, GSG)是中药复方制剂，主要成分有丹参、柴胡(醋制)、白芍、当归、茯苓等13味中药,具有疏肝健脾、保肝护肝等功效，临床主要用于治疗急慢性肝炎、肝硬化[7]。并且对慢性病毒性肝炎、CCl4引起的肝损伤等有一定治疗作用[8-9]。GSG中的柚皮苷还有抗纤维化的作用[10]。前期研究[7,11]表明，GSG能够改善高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎大鼠脂质代谢紊乱及肝脂肪变性，减轻氧化应激水平，但该研究未涉及具体机制。本研究通过体外建立新型3D组织工程(tissue engineering, TE)肝脏NAFLD模型，探索GSG对NAFLD的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 DMEM高糖培养基购自上海Hyclone公司; 胎牛血清、胰酶、青链霉素购自美国Gibco公司; PCR提取试剂盒TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)。GSG浸膏由保定步长天浩制药有限公司提供。蠕动泵购自MasterFlex、0.22 μm滤器(millex-GV)、SDC购自VETEC、一次性静脉留置针(泰尔茂Hybria ⅡB型三通)、油酸、棕榈酸购自Sigma公司、CCK8试剂盒购自DOJINDO公司、油红O染色试剂盒购自Solarbio公司、TG试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.1.2 实验动物 雄性Sprague-Dawley大鼠12只(体质量180～220 g)来自维通利华实验动物中心，实验前动物正常饲养。

1.2 方法

1.2.1 TE肝脏纤维支架的制备 大鼠用10%水合氯醛麻醉，75%酒精消毒腹部，打开腹腔，暴露肝脏及门静脉。用一次性静脉留置针插入门静脉，作为肝血管系统的灌注入口。用1%脱氧胆酸钠(1%SDC)缓冲液(内含20 UL/L磷脂酶A2)通过导管灌流肝脏，将肝脏脱细胞，随后用生理盐水冲洗灌流直到组织变透明。此时得到了脱细胞并保留有全部细胞外基质成分的肝脏支架模型。随后将大鼠透明的肝脏支架模型分离下来，结扎、修剪并保留部分肝叶，悬挂于事先装好DMEM的无菌异形瓶内，连接蠕动泵装置，在37 ℃、5%CO2的培养箱中循环灌流过夜。

1.2.2 细胞培养及模型再细胞化 将HepG2 细胞(购自ATCC)在DMEM完全培养基(含10%胎牛血清和1%青链霉素)中正常培养。每2～3 d传代1次。再细胞化前将HepG2细胞制成细胞悬液，分3次注入循环灌流装置，每次细胞数量为1×107，并以8 ml/min的速度循环灌流。在此期间，HepG2细胞重新进入肝脏支架并进行增殖。24 h后，分别灌注正常的完全培养基(DMEM+10%FBS)和高脂培养基(含1 mmol/L FFA的完全培养基)建立TE肝(正常对照组，n=4)和TE脂肪肝(TE fatty，TEF)模型(FFA组，n=4)。5 d后GSG浸膏(浓度10 μg/ml)干预TEF(FFA+GSG组，n=4)，第8天收集标本(图1)。

1.2.3 高脂培养基配制 将1 mol/L油酸和棕榈酸按2∶1比例混合，加入10 μl NaOH和800 μl DMEM混合并置于60 ℃的超声水浴中震荡30 min。加入3.1 ml 2%牛血清白蛋白，用浓盐酸调节pH至7.4。将制备好的FFA加入到100 ml完全培养基中，制成高脂培养基。

1.2.4 细胞毒性检测Cell Counting Kit 8(CCK8) 将HepG2细胞制成40～60个/μl的细胞悬液，在96孔板中每孔加入100 μl的细胞悬液。培养24 h，向培养板加入不同浓度的GSG浸膏，作用24 h后根据试剂说明书要求，向每孔加入10 μl CCK溶液，将培养板在培养箱内孵20 min，用酶标仪测定450 nm处的吸光度(OD)，并计算细胞增殖-毒性。

1.2.5 油红O染色 将组织的冰冻切片用60%异丙醇洗涤20～30 s，然后在改良油红O染色液染色15 min。再用60%异丙醇及dH2O洗涤，去除非特定结合的染色。最后用苏木精染核，并用Olympus BX51+DP72显微镜拍照。

1.2.6 RNA提取和RT-qPCR 用Trizol提取总RNA，稀释后紫外分光光度计，计算RNA浓度，然后用DNase处理。使用TaKaRa试剂盒反转录后在ABI StepOnePlus机器上运行qPCR,所用引物见表1。数据收集使用ABI7500软件，结果显示以2ΔΔct形式体现，并用GAPDH标准化。

表1 目的基因及内参GAPDH引物

1.2.7 TG的测定 将从肝脏模型中消化下来的HepG2细胞用PBS冲洗干净，并按照试剂盒(TG测定试剂盒，A110-1，南京建城)说明书进行处理。然后，将2.5 μl细胞匀浆加入96孔板中，与250 μl工作溶液混合，37 ℃孵育10 min。在510 nm处测量OD值，并计算TG浓度。

1.3 伦理学审查 本研究方案经由北京佑安医院实验动物伦理委员会审批(批号：AEEI-2020-076)，符合实验室动物管理与使用准则。

2 结果

2.1 TEF模型的建立 再细胞化后的TE肝脏在孵箱中用蠕动泵持续灌注(图2)。正常对照组TE肝脏一直用完全培养基培养。8 d后，FFA组肝脏与正常对照相比，有众多肉眼可见的脂肪聚积(图3)，并且其细胞内TG含量为正常对照组的2倍(t=4.842，P=0.004 7)，同时胰岛素抵抗指标丙酮酸脱氢酶激酶4(PDK4)mRNA水平也显著升高(t=2.784，P=0.031 8)(图4)，表明NAFLD模型制备成功。

2.2 GSG的细胞毒性和降脂效果检测 用普通平面的细胞培养方法首先检测了GSG浸膏的细胞毒性，发现从0.01 ng/ml～1 mg/ml，GSG浸膏均无明显的细胞毒性，安全性良好(图5a)。进一步观察了不同浓度下GSG的降脂效果，发现从100 μg/ml开始其降脂能力呈剂量依赖性，100 ng/ml之后降脂效果不明显，选取10 μg/ml作为实验用药物浓度(图5b)。

2.3 GSG对脂肪肝细胞胞内TG水平和胰岛素抵抗水平的影响 油红O染色结果显示，FFA组肝细胞内有大量的中性脂肪滴，在GSG干预后脂肪滴明显减少(图6a)。通过对TG的定量检测发现，FFA+GSG组肝细胞内TG水平较FFA组下降66%(t=0.055，P=0.003 7)(图6b)。PCR结果显示，FFA+GSG组肝细胞胰岛素抵抗指标PDK4水平也下降了61%(t=3.761，P=0.009 4)(图6c)。

2.4 GSG对肝脏脂质合成途径相关酶的影响 正常生理状态下,肝细胞合成TG主要有2个来源[11]:摄取脂肪组织释放至外周循环中的FFA,酯化生成TG；以葡萄糖氧化产物乙酰辅酶A为原料从头合成脂肪酸,酯化生成TG(图7)。其中前者是肝细胞TG的主要来源。本研究检测了上述两种来源途径中的多种合成酶类如图8所示，GSG干预后其肝细胞的脂肪酸转位酶(CD36)(t=6.552，P=0.007 2)和脂肪酸结合蛋白1(FABP1)mRNA水平(t=4.944，P=0.001 1)显著降低；参与TG从头合成的各种酶的表达也显著下降，包括ACLY(t=2.689，P=0.027 6)、ACC(t=4.524，P=0.020 2)、FAS(t=6.040，P=0.009 1)、FADS2(t=3.758，P=0.005 6)和APGAT5(t=4.443，P=0.047 1)。ApoB mRNA水平也显著下降(t=3.032，P=0.016 3)。

3 讨论

NAFLD是临床常见肝脏疾病, 好发于糖尿病、肥胖患者[12]。长期高脂饮食导致肝脏脂肪摄入过多,肝脏脂肪超载引起代谢障碍, 未经氧化的脂质在肝细胞沉积、变性。此外，代谢性炎症反应、氧化应激、胰岛素抵抗、细胞凋亡等也参与NAFLD病变[13-14]。现实中难以对患者反复行肝脏活检，因此需要能密切反映人类NAFLD的模型进行相关研究[15]。笔者团队Wu[16]等前期创新性地构建了3D TE脂肪肝模型，该模型被证实与NAFLD患者早期的许多临床表现相似，包括高度的胰岛素抵抗、TG沉积、细胞色素酶的变化、白蛋白和尿素氮合成增加。由于模型采用人的肝细胞，因此种属差异性小，是一种良好的NAFLD细胞模型[17-18]。

脂代谢紊乱是NAFLD的主要致病机制之一：肝脏摄取及合成的脂肪酸超过其β氧化及排出能力(在内质网与apoB 组装成VLDL排泌到窦周隙)，导致脂代谢平衡打破，输入大于输出，过多的TG蓄积在肝细胞，导致脂质过度沉积[19]。肝细胞膜上的脂肪CD36介导FFA跨质膜的转运，FFA一旦进入胞质，便与细胞内的“摆渡车”-FABP家族紧密结合，运送到TG代谢部位[20]，被脂酰CoA合成酶激活形成酰基辅酶A。本研究发现，脂肪肝模型的CD36表达明显增高，而GSG干预后其表达下调，表明GSG可通过降低FFA的摄取途径减少TG合成。ACC催化细胞浆内脂肪酸从头合成时乙酰辅酶A向丙二酰辅酶A的转化，是脂质从头合成途径的限速酶。研究[21]表明，特异性敲除小鼠肝细胞ACC,其胞内丙二酰辅酶A含量为野生型小鼠的30%,TG含量仅为野生型小鼠的一半,且脂肪酸β氧化不受影响,表明ACC的缺失可以下调脂肪酸从头合成。而FAS催化丙二酰辅酶A转化棕榈酰辅酶A。有研究[22]表明，脂肪肝时FAS的mRNA、蛋白质水平均显著上调。笔者团队先前的研究[16]与上述情况相一致，NAFLD模型ACC、FAS mRNA水平较TE肝模型显著升高。本实验发现GSG处理后可明显下调脂肪肝细胞的ACC和FAS表达，表明GSG也可以通过减少脂质从头合成来减少TG合成。此外，笔者发现，药物干预后ApoB mRNA水平也显著下降，原因可能是TG的两条来源途径均被削弱，因此TG含量减少，相应地内质网进行装配时对ApoB的需求减少，因此表达下降。另一方面，可能与GSG减少胰岛素抵抗，从而减少VLDL和乳糜微粒的装配和分泌有关[23]。

胰岛素抵抗及随之相应的高胰岛素血症在NAFLD时肝内脂质蓄积中也起着重要作用[24]:一方面, 胰岛素抵抗增强外周脂肪组织TG降解, 抑制FFA酯化, 升高FFA水平, 使肝脏摄取FFA增多; 胰岛素抵抗导致线粒体TG转运蛋白受损, ApoB与TG 结合能力下降[25]。另一方面, 胰岛素抵抗伴随的高胰岛素血症增加肝细胞合成脂肪酸, 并抑制其β氧化, 造成肝细胞内脂质蓄积；高胰岛素血症还过氧化物酶体增生物激活受体α上调相关脂肪酶的表达。在本研究中，使用GSG浸膏可使PDK4水平显著下降，说明胰岛素抵抗改善，肝脏摄取FFA减少，脂质蓄积减少，ApoB与TG 结合能力升高。

综上所述，本研究表明GSG有明显的降脂作用，其机制可能为GSG通过减少FFA的摄取及脂质的从头合成来减少TG的合成，从而减轻肝细胞内脂质沉积，改善脂肪肝的脂代谢，改善胰岛素抵抗，有望为临床NAFLD的治疗提供新的思路。