肝纤维化小鼠模型中弹性蛋白及其调控因子在肝纤维化形成和逆转中的分子机制

杨爱婷，严旭禛，赵文姗，李为雨，陈 巍，尤 红

首都医科大学附属北京友谊医院 科研实验中心，北京市临床医学研究所，国家消化系统疾病临床医学研究中心，北京 100050

肝纤维化是以细胞外基质(ECM)过度沉积为特征的慢性肝脏疾病[1]。除胶原外，弹性蛋白已被证实在肝纤维化尤其在肝硬化阶段大量沉积[1-2]。成熟的弹性蛋白是一种不溶性非极性蛋白，由可溶性单体原弹力蛋白聚合而成[3]。原弹性蛋白分子富含丙氨酸和赖氨酸残基，它们是交联反应的主要位点。此外，在成熟的ECM中，分子间交联增加了弹性纤维的不溶性，使ECM不易被降解，进而限制了纤维化的可逆性。因此弹性蛋白在肝组织沉积可能是部分患者肝硬化无法逆转的原因[4]，但弹性蛋白在纤维化进展过程中的动态变化尚不清楚。本文旨在动态观察弹性蛋白在四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化模型小鼠进展过程中的表达特点，进一步探寻影响弹性蛋白沉积的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用8周龄雄性C57B6/J小鼠[斯贝福，北京；生产许可证编号：SCXK(京)2014-0006；实验动物使用许可证编号：SCXK(京)2017-0019]，动物自由进食、饮水，标准饲料颗粒喂食，室温20 ℃～22 ℃，每12 h明暗循环。

1.2 试剂和仪器 反转录试剂盒(Promega公司)、ABI Power SYBR Green PCR Master Mix试剂盒(Applied Biosystems，USA)、弹性蛋白染液(贝索，珠海)、抗弹性蛋白(MAB2503；Millipore，USA)、抗Ⅰ型胶原(PA5-95137，Invitrogen，USA)，7500快速序列检测器(Applied Biosystems，USA)、Fastin ElastinTMAssay(Biocolor life science assays，UK)、SircolTMInsoluble Collagen Assay(Biocolor life science assays，UK)、LC-MS/MS-IT-TOF高效液质联用色谱仪(Shimadzu，Japan)。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠CCl4肝纤维化形成及自发逆转模型的建立将CCl4溶于橄榄油(CCl4和橄榄油按1∶7体积混合)，给予0.2 ml/100 g腹腔注射，2次/周，连续8周。纤维化进展期组分别于CCl4腹腔注射的第4周和8周末处死小鼠；自发逆转组为8周后停止CCl4注射，在CCl4停止后的第4、6、8、12周末分别处死小鼠[小鼠共30只，根据每个时间点分为6组，分别为进展4周组、进展6周组、进展8周组(逆转0周组)、逆转4周组、逆转8周组、逆转12周组，每组5只]。健康对照组注射0.2 ml/g橄榄油共8周后处死。收集血清、肝脏标本待检测。

1.3.2 肝脏组织病理学染色检查 所有收集的肝脏标本均以4%多聚甲醛溶液固定，经乙醇脱水后石蜡包埋。通过天狼星红染色检测胶原沉积，显微镜下观察以确定肝脏纤维化程度，分为早期肝纤维化以及进展期肝纤维化。通过维多利亚蓝检测弹性蛋白沉积，将切片漂白后，在弹性蛋白染液中浸泡24 h，脱水后中性树胶封片。应用免疫组织化学染色法检测Ⅰ型胶原。

1.3.3 Western Blot检测肝脏组织弹性蛋白和Ⅰ型胶原蛋白 取肝组织20 mg制备蛋白样品。每组取总蛋白20 μg上样，12%SDS-PAGE分离蛋白质，将蛋白转至硝酸纤维素膜上，室温封闭2 h，分别加入抗弹性蛋白一抗(1∶1000)和抗Ⅰ型胶原一抗(1∶1000)，4 ℃孵育过夜，充分洗涤后二抗室温孵育1 h，充分洗涤后，发光、曝光、扫描。以抗β-肌动蛋白抗体作为上样对照。

1.3.4 实时定量聚合酶链反应(qPCR) 检测赖氨酸氧化酶-1(LOXL-1)和Fibulin-1(FBLN-1)用Trizol法提取肝组织中总RNA，使用反转录试剂盒得到20 μl cDNA。通过ABI Prism 7500快速序列检测器和ABI Power SYBR Green PCR Master Mix试剂盒进行qPCR反应。

1.3.5 不可溶弹性蛋白与不可溶胶原测定 不可溶弹性蛋白与不可溶胶原分别通过Fastin ElastinTMAssay和SircolTMInsoluble Collagen Assay测定。交联的弹性蛋白(在肝组织中不可溶解)通过草酸进行热萃取处理，重复热萃取3遍以彻底溶解交联的弹性蛋白。沉淀，离心并与染料试剂结合后，取弹性蛋白-染料复合物沉淀溶于溶液后在513 nm下测量。不可溶胶原的测定方法与之类似。所有样品一式两份以减少误差。

1.3.6 LC-MS/MS鉴定小鼠血清中纤维化进展期和动态逆转期相关的蛋白 将提取的血清去除高丰度蛋白，经Bradford法测定浓度后，制备蛋白样品。进行12% SDS-PAGE电泳上分离蛋白质，考马斯亮蓝染色凝胶1 h后，分为5个馏分，解剖刀将胶带切成1～2 mm2大小的胶片，进行脱色后加入三氟乙酸溶液提取。将高pH反相分离得到的组分用20 μl 2%甲醇、0.1%甲酸复溶，13000 r/min离心后取10 μl上清上样，以分离梯度流速350 nl/min进行液相分离后，进行质谱分析。使用小鼠Uniport蛋白序列库匹配鉴定分析阳平蛋白。将无重复实验的条件下，蛋白的丰度比即差异倍数达到2倍以上，且在逆转过程中随时间逐渐升高或降低的蛋白，视作显著差异蛋白。

1.4 伦理学审查 本研究方案经由北京友谊医院实验动物伦理委员会审批(批号：15-2004)，符合实验室动物管理与使用准则。

2 结果

2.1 弹性蛋白在肝纤维化模型中的表达特征 首先动态观察弹性蛋白在健康对照组、CCl4注射4周(早期纤维化)和8周(进展期纤维化)变化，同时与Ⅰ型胶原进行比较。如下图1a所示，与健康对照组相比Ⅰ型胶原随纤维化的进展表达逐渐升高(P值均<0.05)；进展期纤维化组弹性蛋白与健康对照组相比显著升高(P<0.05)。肝脏病理学Ⅰ型胶原免疫组化染色和弹性蛋白染色的结果提示，与健康对照组相比，早期纤维化组及进展期纤维化组的Ⅰ型胶原阳性面积差异均有统计学意义(P值均<0.05)；早期纤维化组及进展期纤维化组弹性蛋白染色阳性面积差异亦均有统计学意义(P值均<0.05)(图1b)。进一步对不可溶胶原和不可溶弹性蛋白的检测发现，不可溶性胶原随着纤维化进展含量逐渐升高，而不可溶性弹性蛋白仅在进展期纤维化时大量积聚(图1c)。考虑到弹性蛋白酶12(MMP12)是参与弹性蛋白降解的关键基质酶，进一步检测了MMP12的基因表达(图1d)，结果发现MMP12的基因表达水平随纤维化进展显著升高(P值均<0.05)。

2.2 自发肝纤维化逆转模型的建立 成功建立小鼠肝纤维化逆转模型。天狼星红染色结果显示，在小鼠经CCl4注射8周后，开始出现假小叶，间隔连接较为紧密；当停止注射，自发逆转4周后，假小叶结构逐渐消失，纤维间隔变得松散；自发逆转12周时，假小叶基本消失，仅有轻微窦周纤维化(图2)。

2.3 LOXL-1和FBLN-1与肝纤维化疾病相关 使用双向电泳和LC-MS/MS分离并识别血清中与纤维化逆转相关蛋白。共识别筛选出45种表达差异的蛋白，其中25种蛋白随纤维化逆转逐渐升高，20种在蛋白随纤维化逆转逐渐降低(图3)。LOXL-1和FBLN-1参与弹性蛋白沉积。经qPCR证实，LOXL-1和FBLN-1的基因水平在CCl4注射8周达到高峰，且随着逆转时间的延长表达逐渐下降(图4)。

3 讨论

CCl4是一种选择性肝化学毒物，其可通过损害肝细胞，破坏肝细胞中各种成分模拟慢性肝损伤。通过持续注射CCl4诱导肝纤维化模型已成为最常见且最方便的方式之一[5]，该方法具有操作简单、时间短、成模率高等特点。实验动物的病死率与CCl4剂量成正相关。本研究以小剂量CCl4腹腔注射8周，成模率为100%，没有小鼠死亡。同时在停止CCl4注射后，肝细胞可凭借其再生功能恢复其肝组织结构和肝脏功能，这一特征可很好的建立肝纤维化逆转模型。在本实验中，CCl4注射8周后可见典型的肝纤维化组织学特征，如假小叶，紧密的纤维间隔形成。当停止CCl4注射后，经过4、8、12周的自然恢复，肝脏组织学基本恢复正常，假小叶消失，纤维间隔基本消散。

既往人们主要针对ECM中胶原成分研究其分泌和降解过程。大量研究已经证实胶原的沉积与纤维化严重程度明显正相关，可以作为评估纤维化严重程度的指标。但因为胶原的沉积发生在纤维化发生的任何阶段，很难定量评估纤维化逆转的难易程度。最近的研究[6]发现，当ECM中有弹性蛋白的沉积时，ECM很难被降解。

弹性蛋白是弹性纤维的主要成分，是一种不可溶性蛋白，在正常肝组织的血管壁和汇管区都有弹性蛋白的存在，但在纤维化和肝硬化时数量明显增加[4]。弹性蛋白以原弹性蛋白的形式释放，是水溶性蛋白，一旦从细胞释放出来，弹性蛋白形成交联，变成不可溶性，增加了对弹性蛋白酶(巨噬细胞金属弹力酶)抵抗性。弹性蛋白在MMP12的作用下可以降解，形成可溶性肽[7]。

本研究发现，与胶原在随肝纤维化进展而缓慢升高的模式不同，弹性蛋白在早期纤维化中表达并未明显升高，仅在纤维化末期表达显著升高。这一结果提示在纤维化早期时I型胶原率先开始在肝脏中沉积，而到了纤维化末期，为了维持胶原交联的稳定，弹性蛋白开始大量聚集。同时，不可溶弹性蛋白含量测定结果与Western blot结果一致，不可溶弹性蛋白仅在纤维化末期含量明显升高。另外，MMP12是弹性蛋白降解的关键基质酶。本研究发现在纤维化进展过程中MMP12表达增加，提示形成交联的弹性蛋白增加了对弹性蛋白的抵抗力，使弹性蛋白酶很难发挥对弹性蛋白的降解作用。同时新生弹性蛋白不断产生，这有可能是导致肝纤维化在去除病因后仍难以逆转的原因。

本研究与既往研究表明，弹性蛋白与胶原表达模式不同，纤维间隔中的弹性蛋白只出现在纤维化成熟阶段，提示纤维化逆转的难度增加[8]。因此，调控弹性蛋白积聚可成为解决肝纤维化难以逆转的重要靶点之一，但是目前仍缺乏直接的证据说明调控弹性蛋白沉积的重要调节因子。LC-MS/MS可有效的分离待测物品与干扰物，提高灵敏度，十分适用于分析血清中各个组分变化，可明确调控弹性蛋白的关键分子。利用本实验中共筛选出45种差异表达蛋白，25种蛋白在逆转后逐渐升高，20种蛋白在逆转后逐渐降低，其中包括LOXL1和FBLN-1与弹性蛋白沉积相关蛋白。经过RT-PCR验证后提示LOXL-1和 FBLN-1在纤维化进展中表达增高，且在逆转过程中表达降低。FBLN-1 属于纤维蛋白家族，该家族是一个糖蛋白家族，他们都可以与原弹性蛋白相结合。已有研究[9]表明在成纤维细胞中，FBLN-1可通过与FBLN-5相结合沉积在弹性蛋白上，促进弹性蛋白在ECM中的沉积。在肝癌细胞中，MMP13可直接水解FBLN-1[10]，但是未有研究表明降解弹性蛋白的MMP12以及其余成员可直接作用于FBLN-1。同时，FBLN-1不仅可以在大鼠门静脉区检测到，同时在急性肝损伤的肝脏中表达也大量增加，特别是肝细胞和活化的肝星状细胞中[11]。另外，LOXL-1属于赖氨酰氧化酶家族，主要参与胶原的交联[12]。在LOXL-1敲除的小鼠中，MMP2、MMP9、MMP12表达显著升高[13]，弹性蛋白降解可能因此增多。也有研究[14]表明，在血管平滑肌细胞中LOXL-1可通过与FBLN-5相结合，调控原弹性蛋白的组装。目前，干预LOXL-1或FBLN-1后是否可以发挥MMP12对弹性蛋白降解的作用，加速弹性蛋白的降解，从而阻止纤维化进展或者促进肝纤维化的逆转还有待于进一步研究。因此，上述证据表明，FBLN-1与LOXL-1为肝纤维化中弹性蛋白降解的重要调节因子。

综上所述，本研究通过成功建立肝纤维化模型，发现弹性蛋白仅在肝纤维化末期表达明显增加，同时不可溶弹性蛋白含量升高，揭示晚期肝硬化难以逆转的原因。同时通过LC-MS/MS与RT-PCR验证，发现FBLN-1与LOXL-1可能是调控弹性蛋白降解的重要因子。LOXL-1和FBLN-1介导的弹性蛋白降解有可能成为肝纤维化特别是肝硬化和终末期肝病的治疗靶点。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突，特此声明。

作者贡献声明：杨爱婷、严旭禛负责课题设计，资料分析，撰写论文；赵文姗、李为雨、陈巍参与收集数据，修改论文；尤红负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。