楠藤绿原酸超声辅助法提取优化研究

周家红 刘锐 张欣 辛瑞瑞 杜继恒

【摘   要】 楠藤作为民间和民族常用药，有着良好的药用开发前景。采用正交试验法三因素三水平，即超声时间，超声温度，乙醇浓度三个影响因素，每个因素三个水平，最大的影响因素为提取时间，其次为乙醇浓度，最小影响因素则为提取温度。最佳工艺组合为A3B3C1，该提取工艺操作简便，为提取楠藤叶中绿原酸提供理论依据，从而证实其具有抗炎性作用。

【关键词】 楠藤;绿原酸;正交试验;抗炎

楠藤（Musaenda erosa Champ ），为茜草科玉叶金花属攀援灌木植物，其性凉，味微甘。又名厚页白纸扇、大茶根、大洋藤、胶鸟藤、大白纸扇、火烧藤等，常攀援于疏林乔木树冠上，在我国常分布于广东、香港、广西、云南、四川、贵州、福建、海南和台湾等地区。具有清热消炎功效，可治热疥疮，海南民间常用于治疗各种炎症[1]。其作为民间和民族常用药，有着良好的药用开发前景。为了更好地利用楠藤中的绿原酸，减少原材料的浪费， 研究楠藤中绿原酸的提取工艺具有重要意义.本试验通过正交试验，采用超声提取法提取楠藤中的绿原酸， 以不同的超声时间、不同的超声温度、不同的乙醇浓度为提取溶剂，探讨其提取过程中的显著影响因素，并进一步确定楠藤中绿原酸的最佳提取工艺参数，为后期相关研究和工业生产提供理论依据。

1  仪器与材料

超声波清洗器（上海宁商超声设备有限公司  型号：KQ-250B）、分析天平（上海精密科學仪器有限公司 型号：FA2004N）、紫外可见分光光度计（日本岛津  型号：UV-2450），试药为经当地经验丰富的药农实地采集。

2  试验方法

2.1  对照品溶液的制备[2～5]

精密称取1mg绿原酸标准品，置于10mL容量瓶中，加50%乙醇至刻度线，配制成0.1mg/mL的对照品溶液，即为对照品溶液。

2.2  绿原酸的提取

准确称取楠藤叶粉末1g，按1：10的料液比向锥形瓶中加入不同浓度的乙醇，轻微摇晃，使粉末充分溶于溶液中，按照设定的超声浸提时间和超声浸提温度进行超声提取。将提取液进行过滤，取0.1mL滤液移至10mL容量瓶中，加50%的乙醇至刻度线，即为供试待测样品溶液。吸取各供试品溶液，，置于比色池中，在330 nm处测定不同供试品溶液的吸光值。

计算公式：提取率（%）=C（mg/ml）x稀释倍数x提取液体积/样品质量

C—提取液浓度

V—提取液体积

2.3  单因素试验设计

2.3.1 提取温度对提取绿原酸的影响  准确称取1g楠藤叶粉末5份，按按1：10（g/mL）的料液比向锥形瓶中加入50%的乙醇，轻微摇晃，使粉末充分溶于溶液中，按“2.2”中的方法进行提取，条件为：超声时间为30min，温度分别为50℃、60℃、70℃、80℃、90℃。计算绿原酸的提取率，考察提取温度对绿原酸提取率的影响。

2.3.2 提取时间对提取绿原酸的影响  准确称取1g楠藤叶粉末5份，按按1：10（g/mL）的料液比向锥形瓶中加入50%的乙醇，轻微摇晃，使粉末充分溶于溶液中，按“2.2”中的方法进行提取，条件为：超声温度为70℃，时间分别为20min、30min、40min、50min、60min。计算绿原酸的提取率，考察提取时间对绿原酸提取率的影响。

2.3.3 乙醇浓度对提取绿原酸的影响  准确称取1g楠藤叶粉末5份，按按1：10（g/mL）的料液比向锥形瓶中加入浓度分别为40%、50%、60%、70%、80%的乙醇，轻微摇晃，使粉末充分溶于溶液中，按“2.2”中的方法进行提取，条件为：超声温度为70℃，超声时间为30min。计算绿原酸的提取率，考察乙醇浓度对绿原酸提取率的影响。

2.4  正交试验

根据单因素试验结果，以提取液中的绿原酸含量为考察指标，对提取温度、提取时间、乙醇浓度3个因素优选，每个因素设3个水平，用L9（33）正交试验表进行试验，方案见表1。

2.5  统计学方法

试验数据采用统计学软件SPSS17.0进行处理，进行方差分析，以Sig<0.05为差异具有显著统计学意义。

3  试验结果与分析

3.1  标准曲线的绘制

分别汲取2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL、4.0mL对照品溶液，置于25mL的容量瓶中，加50%的乙醇至刻度线。以50%乙醇溶液做空白，于紫外可见分光光度计330 nm处测定吸光值，以吸光值为纵坐标，浓度为横坐标，经方程回归分析，得绿原酸标准曲线回归方程为Y=23.15X+0.051，对照品溶液在8-16μg /m L范围内呈现良好的线性关系，相关系数R2=0.9967，见图1。

3.2  单因素试验结果与分析

3.2.1 提取温度对提取绿原酸的影响  由图2可知，随着超声温度的增加，绿原酸的提取率持续增大。当提取温度为80℃时，其提取率为3.62%，达到最大值。

3.2.2 提取时间对提取绿原酸的影响  由图3可知，随着提取时间的延长，绿原酸的提取率也随之增大。当提取时间为50 min时，其提取率为3.66%，达到最大值。此后，再增加提取时间，绿原酸提取率下降。因此，选择提取时间50 min比较适宜。

3.2.3 乙醇浓度对提取绿原酸的影响  由图4可知，随着乙醇浓度的增大，绿原酸的提取率先增加后减小。当乙醇浓度为50%时，其提取率为3.62%，达到最大值。此后，继续增大乙醇的浓度，绿原酸的提取率反而降低。乙醇浓度较低时，楠藤中的绿原酸不能充分溶出;浓度过高时，楠藤中能够溶解于乙醇中的其他杂质也被溶解了出来，造成绿原酸提取率下降。因此，选择50%的乙醇浓度较为合适。

3.3  正交试验结果与分析

通过对单因素试验结果的分析，以绿原酸提取率为评价指标，采用正交试验优化提取工艺，正交试验设计及结果见表2，方差分析见表3。

由表2直观分析，通过R值可知楠藤中绿原酸的超声提取最大影响因素为提取时间，其次是乙醇浓度，而提取温度则较小影响因素。根据K值知提取温度A3>A1>A2，提取时间B3>B1>B2，乙醇浓度C1>C2>C3，由此可知楠藤中绿原酸超声提取的最佳工艺为A3B3C1。即超声温度80℃、提取时间50 min、40%乙醇的浓度。

由SPSS软件分析得到表3可知，P值大小依次为提取时间<乙醇浓度<提取温度，各影响因素P值均<0.05，均有相关显著性。

对最佳工艺进行3次验证试验，得到绿原酸的平均提取率为4.57%，相对平均偏差为0.25%，表明最佳工艺正确、稳定。

4  结论

在相关研究中已经得到证实，绿原酸对多种致病菌和病毒有较强的抑制和杀灭作用[6]，并且可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路的活化来减少脂多糖诱导AKI的促炎症细胞因子[7]，且降低脂多糖诱导的COX-2的蛋白水平也是绿原酸抗炎的机制之一[8]。绿原酸含量的高低，是关乎楠藤内在质量的标准之一，与药用价值有着直接联系。本试验采用了超声波提取法、正交设计法来研究楠藤叶中绿原酸提取最佳工艺条件。先对超声波提取楠藤中绿原酸的工艺条件进行单因素优化，确定了影响显著因子及各因子最适水平，再在此基础上进行正交优化，并对正交试验结果进行方差分析， 确定了超声波法提取楠藤中绿原酸的最佳工艺，为A3B3C1，即提取温度80℃，提取时间50min，乙醇浓度40%。采用该方法提取楠藤中的绿原酸具有快速、省时、成本低、效率高等优点。试验对楠藤中的绿原酸进行提取工艺优化，证实楠藤绿原酸含量较高。楠藤作为植物提取类药物，不仅药物副作用小，而且还增加了抗炎类药物品目，从而减轻了目前各类抗炎性药物长期服用耐药性问题，具有广阔的抗炎性药物开发前景。

对楠藤进行药理试验研究，对其抗炎疗效还需进行相关试验，并进一步明确其抗炎机理过程。

参考文献：

[1] 國家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草.第十八卷[M].上海：上海科学技术出版社， 1999：453.

[2] 谢培德，林雀跃，张荣林，罗永强.高效液相色谱法测定广西不同产地楠藤中5种成分的含量[J].广西医科大学学报，2019，36 （01）：133-136.

[3] 李学玲，张建强，刘兴元，郑 琰，黄竹珺.牛蒡不同部位绿原酸的提取与含量比较[J].云南化工，2018，45（12）：65-68.

[4] 赵梦瑶，张文杰，张立攀，王法云，陈俭春.正交优化超声辅助法提取杜仲叶中绿原酸的工艺研究[J].食品研究与开发，2019，0（03）：93-97.

[5] 易梦媛，邓爱华，刘凤英，王 云，谢 鹏，卢俊明，王 志.响应面法优化栀子中绿原酸的提取工艺[J].农产品加工，2019（05）：26-29.

[6] 丘 岳. 广西山银花提取物绿原酸抗炎作用及其分子机制研究[D].广西医科大学，2009.

[7] 徐静红，毛艳菲.绿原酸对脂多糖诱导的急性肾损伤小鼠的保 护作用[J].医药导报，2019，38（07）：860-864.

[8] 抗晶晶，张丽娟，刘晓宁，殷志敏.绿原酸对脂多糖致炎症小鼠体内体外COX-2的影响[J].河南师范大学学报（自然科学版），       2017，45（05）：49-52.

（编辑：李丹）