富硒叶面肥安全性评估方法建立

耿敬章，陈俊杰，杨萌，孟莉，贺博，唐德剑，杨水云*

(1.西安交通大学生命科学与技术学院，陕西省营养与健康工程研究中心，陕西 西安 710049； 2.陕西理工大学 生物科学与工程学院，陕西 汉中 723000； 3.农业农村部富硒产品开发与质量控制重点实验室，陕西 安康 725000)

硒是人体必需的微量元素之一，在多种主要代谢途径中发挥重要的作用，参与人体甲状腺激素代谢、抗氧化防御系统和免疫功能[1-2]。硒缺乏会导致一系列严重疾病的发生，如癌症、心血管疾病和炎症等，以及其他自由基相关的问题、过早衰老等[3-12]。

硒在地壳中的分布极不均匀，因此，并不是所有地区的人们都可以仅通过地域性饮水和饮食就获取满足人体需求量的硒。芬兰曾经是一个几乎全境缺硒的国家，政府经过多年努力，在农田普遍施用硒肥，才逐渐使得芬兰人的平均硒摄人量达到了推荐标准，是一个人为改变缺硒状况的成功案例。

目前，我国市场出现了各种硒肥，除根内硒肥外，还有很多速效富硒叶面肥。富硒叶面肥具有无机硒、有机硒和纳米硒等多种形式，但其中所含有的硒的形态或比例，仅从外观上是很难区分判断的。无机硒具有较高的毒性。直接喷施无机硒将导致大量无机硒残留，可能导致人畜食用后中毒，具有安全隐患。同时，市场上的硒肥名称尚未加规范，许多都标有“有机硒肥”，容易误导使用者。为了建立健全监管机制和手段，亟须建立富硒叶面肥中无机硒占比的测定和评价方法。

本研究拟采用高速离心法去除纳米硒，测定上清液中的总硒，用原液总硒和上清液残留总硒的差值即可得到纳米硒占比。取除去纳米硒的上清液采用沉淀和有机萃取法去除有机硒，然后测定上清液中的硒含量(即无机硒含量)，计算可得无机硒占比，以快速准确地评估硒肥使用的安全性。现总结报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

以市售有机硒叶面肥作为研究对象。分析检测中用到的三氯乙酸、NaOH、硼氢化钾、环己烷、盐酸、硝酸等试剂均为分析纯。

硒标准液，购自国家标准物质中心，质量浓度为1 mg·mL-1。取0.02 mL 1 mg·mL-1的硒标准样品溶液定容于100 mL，低温保存。

1.2 仪器设备

主要设备包括：EHD-24电热消解仪，北京东航科仪仪器有限公司；Mars6高通量密闭微波消解系统，美国CEM公司；LC-AFS 6500液相色谱-原子荧光联用仪，北京海光仪器有限公司；UV-8000S紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司。

1.3 溶液配制

20 g·L-1硼氢化钾碱溶液：20 g硼氢化钾，溶于NaOH溶液(5 g·L-1)中混匀，现配现用。

三氯乙酸母液(300 g·L-1)，用时稀释。

1.4 硒肥中总硒含量的测定

参照GB 5009.93—2017对硒肥原液中的总硒含量进行测定，计为C0，单位为mg·L-1。

1.5 硒肥中纳米硒含量测定

观察所购买的富硒叶面肥发现，硒肥呈红色液体且底部有红色沉淀，推断产品中含有纳米硒。将富硒叶面肥溶液在13 000g的条件下高速离心10 min，去除溶液中的纳米硒颗粒。矫正溶液体积等同出发溶液体积后测定无纳米硒上清液中的总硒含量(C1)，则纳米硒含量Cn=C0-C1，纳米硒占比为(C0-C1)/C0。

1.6 硒肥中无机硒占比测定

取无纳米硒的上清液，加入三氯乙酸，使其终浓度为15%，剧烈混匀，10 000g高速离心15 min，去除可能的有机硒蛋白沉淀，取蛋白上清液加入环己烷，萃取可能存在的小分子有机硒，剧烈混匀后静置，观察环己烷和水相之间的界面，以界面清晰狭窄为终点，否则需要在去除有机相后重复萃取。

收集全部水相，待定容体积与出发溶液体积一致后测定其中的总硒含量，视为无机硒含量Ci。无机硒与总硒的比值(Ci/C0)即为无机硒占比。

1.7 方法的加样回收率与精密度测定

利用加样回收率来衡量方法的准确度。实验分组：一组加入标准样和稀释后的硒肥样品，加样量分别为待测硒含量的80%、100%和120%，每组实验平行3次；第二组直接测定稀释后的硒肥样品。2组待测样品分别用上述方法测定硒含量，最终计算出回收率和相对标准误(RSD)。理论上，加样回收率不应低于80%。

2 结果与分析

2.1 硒标准工作曲线

设置系列标准浓度(1.0～20 μg·L-1)，使用仪器自动稀释。以质量浓度为横坐标(x)、荧光强度为纵坐标(y)，制作标准曲线，拟合的标准曲线为y=122.68x-91.10，决定系数R2=1.000 0，可利用此标准曲线测定硒肥中的硒含量。

2.2 硒肥中的总硒含量

对硒肥原液进行稀释度优化，使测定结果落在工作曲线范围内。经优化，在10-4稀释度下进行富硒叶面肥总硒含量测定，5次测定结果的平均值为(6 004.08±21.78)mg·L-1，与其说明书标注的总硒含量≥5 000 mg·L-1相符，测定结果的RSD为3.62%。

2.3 硒肥中的纳米硒含量

取样品稀释度为10-4的硒肥溶液，13 000g高速离心10 min，取上清液测定C1为(2 061.40±84.00)mg·L-1，与总硒含量的差即为纳米硒含量，理论计算Cn为3 942.68 mg·L-1，纳米硒占比为65.67%。

2.4 硒肥中的无机硒含量

取稀释度为10-4的样品稀释液，与体积分数为30%的三氯乙酸溶液等体积混合，使三氯乙酸的终体积分数为15%。按照前述方法去除有机硒，测得硒肥中Ci为(2 060.00±96.00)mg·L-1，6次测定结果的RSD为1.93%。计算可知，无机硒占比为34.31%。

以上测定结果表明，所测硒肥中硒形态主要是纳米硒，在总硒中的占比为65.67%，无机硒占比34.31%左右，二者之和几乎与总硒相等，同时，离心上清液采用三氯乙酸沉淀蛋白和环己烷萃取物，进行硒含量测定，硒未检出，说明硒肥中几乎不含有机硒成分。

2.5 方法的加样回收率与精密度

根据测定结果，计算加样回收率与精密度，结果见表1。经测算，平均加样回收率为98.83%，RSD为1.47%，完全可满足实验检测要求，说明用此方法测定硒肥中的无机硒含量准确可靠。

表1 检测方法的加样回收率

3 小结

市售硒肥多标称为有机硒肥，但其中的无机硒常占很大比例，而相对于纳米硒和有机硒，无机硒毒性较高，因此，检测硒肥中的无机硒含量对于评价硒肥安全性十分必要。采用超高速离心的方法去除纳米硒，用三氯乙酸沉淀蛋白、环己烷萃取小分子有机物的方法去除有机硒，建立起一套适用于富硒叶面肥中纳米硒和无机硒含量检测的方法。经测试，该方法的加标回收率为98.83%，RSD为1.47%，说明所建立的方法是可信的。通过所建方法，测得市售某富硒有机肥中总硒浓度为(6 004.08±21.78) mg·L-1，与其说明一致，其中纳米硒占比为65.67%，无机硒占比为34.31%，几乎不含有机硒，可见所标称的有机硒肥并不是真正意义上的有机硒肥。本实验为硒肥中无机硒含量占比检测提供了思路，在肥料安全性监管和农产品质量控制方面具有积极的现实意义。