PMEL-17基因在三穗鸭不同组织中的表达

祝永才，杨胜林，谭斌，周璇，杨世皓，罗林丽

(贵州大学 动物科学学院，高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025)

三穗麻鸭是贵州省著名的蛋用麻鸭品种，具有产蛋量高、成熟期短、善于行走、觅食能力强等特点，最突出的优点是耐粗饲、产蛋率高、脂肪含量低、肉质细嫩，富含多种人体必需氨基酸等营养成分[1]。已有三穗麻鸭的研究多集中于生产性能、营养成分和疾病预防，其行为学的研究较少。禽类啄羽行为是家禽啄击同伴羽毛的一种非争斗性的异常行为[2]。鸡、鸭、鹅、鹦鹉等禽类都会表现啄羽行为，被啄的家禽生长缓慢、羽毛残缺、皮肤出血、溃烂，甚至引起死亡[3]。在高强度生产、集约化养殖的大背景下，蛋禽的啄羽行为对畜牧生产和动物福利造成了不可忽略的负面影响。

前黑素小体蛋白(premelanosome protein-17，PMEL-17)，是黑素小体形成淀粉样纤维的关键蛋白，在黑色素的形成和沉积中发挥重要作用[4-5]。已有研究发现，PMEL-17基因与家禽啄羽行为的发生存在一定的相关性[6-10]。本研究以有啄羽行为和无啄羽行为的三穗鸭为研究对象，分析PMEL-17基因在三穗鸭不同组织中的表达量，一方面是为了研究三穗麻鸭PMEL-17基因在不同组织中表达量规律，另一方面也为进一步探讨蛋鸭啄羽行为的发生机制提供依据，在优良家禽育种、生产管理、动物福利等方面都具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

6月龄三穗鸭购自三穗县兄弟养鸭厂，检疫合格、健康状况良好。RevertAid Firt Strad cDNA Synthesis Kit K1621购自北京赛默飞世尔科技有限公司，Ultra SYBR Mixture SYBR GreenⅠ购自北京康为试剂生物科技有限公司。荧光定量PCR仪采用BIO-RAD CFX massage系统。

1.2 方法

1.2.1 处理设计

选取120只三穗鸭置于贵州大学养殖场内进行行为学观察。分别于上午、下午相同时间，使用行为学软件Media Record记录当日三穗鸭是否发生啄羽行为，连续记录3周。连续不间断地啄同一只鸭4 s以上时定义为发生啄羽行为，若将羽毛拔出，则定义为重度啄羽行为。根据其有无啄羽行为，将三穗鸭分为啄羽行为组和正常行为组。饲养期间，保证日粮营养充足，自由采食、饮水，定期打扫鸭舍卫生，定期清理粪便并消毒，保持鸭舍良好通风，以保证三穗鸭处于良好的饲养环境。

1.2.2 样品采集

试验结束后，随机选出表现出啄羽行为和表现正常的三穗鸭各3只，采集心、肝、脾、肺、肾、肠、脑、胸、腿、眼、肌胃和腺胃共12个组织样品，放入冻存管中-80 ℃保存备用。

1.2.3 引物设计

参照NCBI数据库中GeneBank所公布的鸡PMEL-17基因的mRNA序列(登录号：NM_205112.2)和鸭内参基因β-actin(登录号：NW_004677060.1)，利用Primer 5.0引物设计软件设计引物。引物序列由生工生物(上海)有限公司合成。引物优化体系：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。引物序列与扩增条件见表1，确定最佳退火温度为58 ℃。

表1 引物信息

1.2.4PMEL-17基因检测

采用Trizol法提取样品总RNA，微量紫外分光光度计测定浓度及D值，采用反转录试剂盒反转录获得cDNA第一链。采用SYBR GreenⅠ法对PMEL-17基因在各组织中的表达进行实时荧光相对定量分析。反应体系为：混合反应液25 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，补足ddH2O至50 μL。反应以鸭内参基因β-actin为参照基因，每个组织样品的目的与内参基因均重复检测3次。反应程序：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环；60 ℃ 5 s，90 ℃ 50 s。

1.2.5 数据统计与分析

运用2-ΔΔCt法计算各基因在不同组织中的相对表达量，分析PMEL-17基因在三穗麻鸭各组织中的表达差异。使用Excel 2010统计原始数据，SPSS 18.0进行单因素方差分析，Duncan法进行多重比较，基因表达量以平均数±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 总RNA提取检测

从三穗鸭12个组织中提取总RNA，经微量紫外分光光度计测定，各样品总RNAD260/D280均在1.80～2.01，D260/D230均在2.0以上，且各组织样品最大吸收峰值均在260 nm处，说明提取的样品总RNA纯度良好，无蛋白质及其他杂质污染，可用于下一步试验。

2.2 PMEL-17基因的PCR扩增

三穗鸭部分组织样品PMEL-17基因的PCR扩增产物用0.5%的琼脂糖凝胶检测结果见图1。从图1可以看出，PCR产物为一明亮的单带，产物大小为226 bp，是目的基因。

图1 PMEL-17基因的PCR产物检测结果

2.3 荧光定量PCR检测PMEL-17基因表达

三穗鸭PMEL-17基因在各组织的相对表达量见表2。由表2可知，三穗鸭啄羽组和无啄羽行为组中，PMEL-17基因在各组织样品中均有表达，脑组织中相对表达量最高，心脏次之，肌胃中的相对表达量最低。

表2 PMEL-17基因在各组织中的相对表达量

除脑、心、胸组织外，啄羽组三穗鸭PMEL-17基因在其他组织中的表达量均低于正常行为组。啄羽组脑组织中PMEL-17基因表达量显著高于正常组脑组织(P<0.01)。

3 讨论

PMEL-17基因是稀释基因家族成员之一，缺乏PMEL-17基因或表达突变的PMEL基因的动物表现出不同程度的色素减退和色素细胞死亡[11]，是调控动物毛色的主要候选基因[12-13]。彭灿阳[14]研究发现，PMEL17基因的表达丰度影响雪峰乌骨鸡黑色素沉积。姚文成等[15]研究发现，PMEL-17基因1904(C/G)、1961(T/C)和2143(A/G)位点基因型分布与鸭羽色具有显著或极显著差异。PMEL-17基因在动物组织中表达的研究较少，在动物啄羽行为的组织表达研究还未见报道。

鸡羽毛的颜色主要与PMEL-17的基因型有关，其中显性白、暗褐色和烟熏色是显性白位点的等位基因，是影响家鸡羽毛颜色的主要位点之一。显性白和暗褐色均抑制黑色真黑素的表达[16]。鸡的PMEL-17显性白是影响羽毛颜色的主要位点之一，利用这一遗传标记，通过testcross分析鉴定了种系嵌合鸡[17]。

鸡啄羽行为与羽毛颜色的候选基因PMEL-17相关。白色羽毛母鸡在追逐、攻击、啄食和威胁行为特征上表现出明显高于红色羽毛母鸡的攻击性，如果将红白鸡混在一起可以减少攻击性行为的发生[18]。在排除不良环境影响的情况下，PMEL-17基因型在鸡的攻击行为、探索行为和恐惧行为表现有差异性，并对其有直接影响[8]。Keeling等[10]研究发现，PMEL-17突变可以防止鸡的啄羽行为。本试验中，PMEL-17基因在三穗鸭心、肝、脾、肺、肾、肠、脑、胸、腿、眼、肌胃和腺胃等12个组织中均有表达，且相对表达量存在差异。PMEL-17基因在啄羽组三穗鸭脑组织中表达量最高，与Karlsson等研究结果一致[19]。PMEL-17基因在组织中的表达规律与家禽的啄羽行为的发生具有一定的相关性，推测家禽啄羽行为的发生可能受到脑部某个区域神经的调控，然而其相关性及调控机制还需进一步研究验证。