超声-乙醇法提取塞北紫堇总生物碱工艺优化*

钱宇超,卢永昌*,姚 政,辛青霞,潘国庆

(1.青海民族大学药学院,青海西宁810007;2.青海民族大学青海省青藏高原植物资源化学研究重点实验室,青海西宁810007;3.青海民族大学青海省药物分析重点实验室,青海西宁810007)

塞北紫堇(corydalis impatiens)为罂粟科紫堇属植物。分布于我国西藏、青海、四川、甘肃等地。青海藏医称塞北紫堇为“扎桑”,作为“帕下嘎”的代用品,有活血散瘀、祛风利气、除湿止痛等功效。塞北紫堇的主要药理成分为生物碱[1]。

常用的溶剂总生物碱提取法有微波辅助提取法、酶辅助提取法、超微粉碎法、机械化学辅助提取法、超声-酸水提取法等。而超声-乙醇提取法相比其他方法有着提取耗时短、提取率高、操作简便等优势[2]。研究塞北紫堇的超声-乙醇法总生物碱提取工艺,对该药材的后续研究与工业化生产有着重要意义。

1 材料与仪器

1.1 药材

塞北紫堇采自青海省西宁市凤凰山,由青海民族大学潘国庆教授鉴定为罂粟科紫堇属植物corydalis impatiens。样品采集后放置于背光处阴干,粉碎后过40目筛,经烘箱烘至恒重。装进密封袋保存于冰箱。

1.2 实验试剂

甲醇(分析纯,天津市富宇精细化工有限公司,批号：20181225);95%乙醇(分析纯,天津市红岩化学试剂厂,批号：20181023);原阿片碱(纯度＞98%,中国药品生物制品检定所,批号：110853-201804);溴甲酚绿(分析纯,天津市大茂化学试剂厂,批号：20170514);氢氧化钠(分析纯,天津市百世化工有限公司);邻苯二甲酸氢钾(分析纯,天津市大茂化学试剂厂)。

1.3 实验仪器

UPH-IV-10T型超纯水机(成都超纯科技有限公司);R-215型旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司);恒温鼓风干燥箱(上海琅玕实验设备有限公司);TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司);T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司);KH-300DE型数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司,300W,50HZ);FA2104电子天平(舜宇恒平仪器厂)。

2 实验方法

2.1 总生物碱溶液的制备

精密称取10 g备用药材放入锥形瓶中,加入200 mL的85%乙醇超声提取,抽滤后由旋转蒸发仪浓缩,加氨水调节pH至10,用氯仿萃取后回收萃取液,挥干后用甲醇定容至20 mL。

2.2 显色剂与缓冲溶液的配置

显色剂：精密称取溴甲酚绿0.1 g,加入0.05mol/L的氢氧化钠溶液2.8 mL,充分溶解后,再定容至200 mL。缓冲溶液(pH为4)：精密称取10.2 g邻苯二甲酸氢钾溶解于1 L的RO水中。

2.3 总生物碱最大吸收波长的确定

精密吸取1mL总生物碱溶液至分液漏斗,再加入氯仿5 mL、缓冲液4 mL、显色剂2 mL。振荡后静置分层,分液取氯仿相。空白对照为氯仿,行最大吸光度扫描确定波长范围为200～800 nm。

2.4 原阿片碱标准曲线的绘制

精密吸取0.177 mg/mL的原阿片碱甲醇溶液各 1、2、4、6、8mL于10mL容量瓶中,由甲醇定容至10 mL。以2.3中所示方法测定420 nm波长下的吸光度。以浓度为横坐标(X)、吸光度为纵坐标(Y)绘制标准曲线。

2.5 提取工艺的单因素实验

精密称取1 g塞北紫堇,分别考察不同乙醇浓度、液料比、提取时间、提取功率时的总生物碱得率。

2.6 响应面法优化实验

以单因素实验为基础,采用B-B设计4因素3水平响应面实验。实验因素水平表见表1。

表1 响应面考察因素与水平Table 1 Factors and levels coding of response surface analysis

2.7 总生物碱的得率测定

提取后的总生物碱溶液按照2.3中所示方法测定波长420

nm处吸光度。由以下公式计算总生物碱得率：

Y为生物碱得率,单位为mg/g;C为经标准曲线算得的总生物碱浓度,单位为mg/mL;V为提取液总体积,单位为mL;M为药材质量,单位为g

2.8 响应面法数据分析

响应面法总实验结果使用Design-Expert软件进行分析,软件版本号为V8.0.6。

3 实验结果

3.1 最大吸收波长

用可见分光光度计扫描(200～800nm波长)。以波长为横坐标,吸光度为纵坐标制图,显示最大吸收波长处于420 nm处,见图1。

图1 总生物碱提取液吸收波长图Figure 1 Absorption spectra of total alkaloids extract

3.2 标准曲线

标准曲线回归方程为y=0.4082x-0.0113,R2=0.9992,表明该方法在0.0177～0.1416 mg/mL范围内线性关系良好,标准曲线见图2。

图2 标准曲线图Figure 2 Standard curve

3.3 单因素实验结果

3.3.1 乙醇浓度

其他条件相同,不同乙醇浓度对总生物碱得率的影响如图3所示。

图3 乙醇浓度对总生物碱得率的影响图Figure 3 Effect of ethanol concentration on extraction rate

3.3.2 液料比

其他条件相同,不同液料比下总生物碱得率如图4所示。

图4 液料比对总生物碱得率的影响图Figure 4 Effect of liquid/solid ratio on extraction rate

3.3.3 提取功率

其他条件相同,不同提取功率下总生物碱得率如图5所示。

图5 提取功率对总生物碱得率的影响图Figure 5 Effect of ultrasonic power on extraction rate

3.3.4 提取时间

其他条件相同,不同提取时间下总生物碱得率如图6所示。

图6 提取时间对总生物碱得率的影响图Figure 6 Effect of ultrasonic time on extraction rate

3.4 响应面法实验结果

经计算后,实验结果如表2所示。

表2 响应面实验结果Table 2.Results of response surface experiment

3.5 响应面实验结果

将实验结果输入Design-Expert.V8.0.6软件,结果的方差分析情况如表3所示。

表3 响应面实验结果方差分析情况Table 3 The analysis of variance.Results of the regression model

由软件得出的回归模型方程：生物碱得率Y=2.49-0.12A+0.12B-0.29C-4.167E-003D+0.19AB+0.087 AC+0.12AD +0.075BC-0.095BD-0.052CD-0.62A2-0.29B2-0.17C2-0.60D2

Y为生物碱得率,单位为mg/g;A为乙醇浓度,单位为%;B为液料比,单位为mL/g;C为提取时间,单位为min;D为提取功率,单位为W

由表3可知,模型的P＜0.0001,模型差异极其显著,表明方程有效。模型的失拟项P=0.4866＞0.05,失拟项不显著,证明模型拟合良好,误差小。模型R2=0.9807＞0.9,证明该模型与实验数据具有高拟合度,该模型可用于分析最优工艺条件。

一次项除D(提取功率)以外均达到显著,二次项 A2、B2、C2、D2均达到极显著。 交互项中 AB、AD对总生物碱的提取达到显著,AC、BC、BD、CD不显著。综合各项数据可以得出各提取条件对总生物碱提取的影响以重要性排序依次为C(提取时间)＞B(液料比)＞A(乙醇浓度)＞D(提取功率)。提取条件的交互作用可以由三维响应面来直观反映,见图7。

图7 提取条件之间的交互作用对提取率的影响示意图Figure 7 Influence of interaction among extraction condition on the extraction rate

由Design-Expert.V8.0.6软件求Y值最大时的最优提取条件,软件分析得出该条件为乙醇浓度：83.52%,液料比：40.88 mL/g,提取时间：42.42 min,提取功率：181.01W,生物碱得率：2.62625 mg/g。 由于实际操作的限制,将条件修正为乙醇浓度：84%,液料比：41 mL/g,提取时间：42.5 min,提取功率：180W。平行进行3次提取,经计算后生物碱得率分别为 2.717、2.691、2.711 mg/g(RSD=0.5%),与理论值的相对误差为3.05%,证明该模型有效反映了各提取条件与生物碱得率的变化关系。

4 结论

本实验使用酸性染料比色法测定总生物碱得率,在单因素实验的基础上设计的响应面法优化了塞北紫堇总生物碱的乙醇超声提取法,得到了最优工艺。经验证,最优工艺下的理论值与实际值相对误差仅为3.05%,证明响应面法考虑了多种因素的交互作用,实验结果准确可靠,对工艺的优化效果显著。