优质食味粳稻辽粳433和越光糙米代谢产物差异分析

2020-07-20 09:33沈枫蒋洪波刘博张秀茹刘军解文孝姚继攀马亮
中国水稻科学 2020年4期
关键词:半乳糖食味糙米

沈枫 蒋洪波 刘博 张秀茹 刘军 解文孝 姚继攀 马亮

(辽宁省水稻研究所, 沈阳 110101; *通信联系人, E-mail: malhd@126.com)

水稻是世界上重要的主食作物,在100多个国家均有种植[1],种植面积约占世界耕地面积的11.5%[2]。稻米是人们摄取热量、蛋白质和微量元素的来源之一。稻米中微量营养素不仅在水稻自身代谢和抵御逆境中发挥重要作用,也关系到人类营养和健康[3-5]。随着经济的发展和生活水平的提高,兼顾水稻产量的同时提高稻米品质成为我国粮食生产的主要方向[6]。

目前针对稻米品质和营养元素有较多研究,包括稻米品质的影响因素[7]、大米中酚类物质的营养价值[8]和次生代谢物的抗氧化活性[9]等。代谢组学(Metabolomics)是继基因组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科[10],已成功应用于稻米及食品科学研究领域。Feng等[11]利用气相色谱-质谱联用技术发现不同水稻代谢物具有地域来源信息。Song等[12]对籽粒的代谢进行分析并为提高稻谷的食味品质提供新思路。Heuberger等[13]利用代谢组学选择营养价值更高和具有保健功能的水稻品种。

随着消费者和稻米市场对优质稻米青睐程度的上升,各国先后培育出一批优质食味水稻品种。日本是世界上研究稻米食味起步最早的国家[14],越光是日本最具有代表性的优质大米之一,尤其日本新潟县生产的越光米更是久负盛名。辽宁省近年来育成了多个优质高食味常规粳稻和杂交粳稻品种,其中辽粳433在2013年全国优良食味粳稻品评中荣获一等奖,食味品质分超过在辽宁种植的越光[15]。辽宁省东港市与日本新潟县有类似的地理环境且纬度相近,是我国优质大米生产基地之一。本研究以种植在辽宁省东港市的辽粳433和越光为研究对象,用GC-MS技术测定其代谢产物,分析与营养相关的代谢产物,评价辽粳433的营养价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验品种为辽粳433(辽星1号/幸实为母本,港源 8号为父本)和越光(Koshihikari)。种子由辽宁省水稻研究所提供。试材种植在辽宁省东港市,土壤基本理化性质为有机质含量 16.7 g/kg,全氮含量11.2 g/kg,碱解氮含量109.36 mg/kg,速效磷含量10.73 mg/kg,速效钾含量137.6 mg/kg,pH值6.6。

种子完全成熟后于2018年10月15日收获,室温自然风干 3日,含水量控制在 13%~15%。每个品种6个处理,每个处理1穴,每穴稻谷经脱壳后获得糙米,液氮冷冻,-80℃下保存。

1.2 气相色谱-质谱(GC-MS)分析

液氮冷冻的糙米放于液氮预冷的冷冻磨碎机中磨碎成粉末状。精密称取60 mg粉末样本,放入1.5 mL的离心管中,360 μL的冷甲醇和40 μL的内标(0.3 mg/mL L-2-氯-苯丙氨酸),在-80℃冰箱中放置2 min,超声提取30 min。加入200 μL的氯仿和400 μL的水,超声提取30 min。离心10 min(12 000 r/min,4℃),取300 μL的上清液装入玻璃衍生瓶中,用离心浓缩干燥器挥干样本,向玻璃衍生小瓶中加入 80 μL的甲氧胺盐酸盐吡啶溶液(15 mg/mL),37℃震荡培养箱中肟化反应90 min。再加入80 μL的BSTFA(含1% TMCS)衍生试剂和20 μL的正己烷,70℃下反应60 min,室温放置30 min。

使用美国安捷伦公司的7890B-5977A GC/MSD气质联用仪对样品进行GC-MS代谢组学分析。色谱条件如下:DB-5 MS毛细管柱(30 m × 0.25 mm×0.25 μm),载气为高纯氦气,流速 1.0 mL/min,进样口的温度为260℃。进样量1 μL,分流比4∶1,溶剂延迟5 min。质谱条件如下:电子轰击离子源(EI),离子源温度230℃,四级杆温度150℃,电子能量70 eV。扫描方式为全扫描模式(SCAN),质量扫描范围为m/z 50~500。为检测这个分析过程的重复性,在每9个分析样本中插入1个质控样本(等量取9个样本混合)。

将 GC-MS原始数据经软件转换,导入MS-DIAL软件进行峰识别,与公共数据库Fiehn匹配相似度实现化合物定性,每种物质在质谱中的响应信息经过转换得到丰度值即为相对定量值。

1.3 统计分析

每个品种的 6个独立样本经过在线软件(http://www.metaboanalyst.ca/)进行品种间代谢物的PCA(principal components analyses)、PLS-DA(partial least-squares discrimination analysis)、t检测和差异代谢通路分析[16]。

2 结果与分析

2.1 GC-MS检测数据分析

对辽粳433和越光的糙米进行GC-MS检测,两个品种的糙米中均定性到233种代谢产物,有机酸55种,碳水化合物及类似物65种,氨基酸类38种,次生代谢物30种,维生素类11种,核苷酸类11种,其他23种。辽粳433糙米代谢产物相对含量比越光高的有158种,占检测到的代谢产物总数的67.81%,包括有机酸39种,碳水化合物及类似物40种,氨基酸类22种,次生代谢物23种,维生素类7种,核苷酸类9种,其他18种。

图1 辽粳433与越光糙米代谢产物之间PCA和PLS-DA分析Fig. 1. PCA and PLS-DA of metabolites of Liaojing 433 and Koshihikari.

2.2 辽粳433和越光糙米中代谢产物的多元统计分析

利用在线软件对辽粳433与越光糙米中代谢产物进行PCA和PLS-DA分析。从PCA(图1-A)和PLS-DA(图1-B)分析图中可见,主成分1分别解释了总变异的22.4%和22.3%,辽粳433与越光糙米代谢物沿着主成分1明显分离,说明辽粳433与越光糙米代谢物组成有明显差异。模型拟合度参数 R2值为 0.9669,Q2值为 0.7600,表明模型的预测能力较高。

2.3 辽粳433和越光糙米中差异代谢产物分析

利用变量权重(variable importance, VIP)进行比较分析,用VIP>1.0进行差异代谢产物鉴定,鉴定出辽粳433和越光的糙米之间存在显著差异的代谢物49种。用t检验法鉴定了两个品种间P<0.01的显著差异的代谢物,结果表明,辽粳433与越光糙米之间有39种代谢物含量有显著差异(表1)。

综合PLS-DA分析和t检测差异代谢产物,辽粳433和越光糙米之间共有64种差异代谢产物,占总数的27.47%。包括16种有机酸(3-羟基苯甲酸、四氧酸、β-甘油磷酸、双半乳糖醛酸、二十二碳烯酸、延胡索酸、半乳酸、半乳糖醛酸、氨基葡萄糖酸、乳酸、乳糖酸、二十八酸、核糖-5-磷酸、琥珀酸、海藻糖-6-磷酸和尿酸)、13种碳水化合物及类似物(1,5-脱水葡萄糖醇、2-酮葡萄糖二甲基缩醛、6-脱氧葡萄糖、阿拉伯糖醇、β-甘露醇甘油酯、纤维二糖、1, 2, 3, 4, 5, 6, 6-氘代葡萄糖、甘油、磷酸甘油酯、帕拉金糖醇、核糖醇、三糖和木糖)、5种氨基酸(鸟氨酸、瓜氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸和赖氨酸)、6种维生素(α-生育酚、泛酸、肌醇、亚油酸、油酸和肌醇-4-单磷酸)、14种次生代谢物[1, 2, 4-苯三酚、3-羟基-3-(4'-羟基-3'-甲氧基苯基)丙酸、5-羟基-3-吲哚乙酸、5-甲氧色胺、胍基丁胺、儿茶素、绿原酸、己内酰胺、阿魏酸、N-乙酰-D-己糖胺、N-乙酰半乳糖胺、苯乙酰胺、腐胺和奎宁酸)];核苷酸类2种(2-脱氧鸟苷和鸟苷)和其他8种[1-甲基海因、2-(哌啶基)苯甲腈、肌酐、胱硫醚、5-单磷酸胞苷、胞嘧啶、肌苷和辛烷醛]。

将两个品种的差异代谢产物数据进行聚类分析(hierarchical cluster analysis,HCA),如图 2 所示,64种差异代谢产物被分为两大簇,具有相对变化趋势的代谢物聚在一起。1-甲基海因、辛烷醛、苯乙酰胺、肌醇-4-单磷酸、3-羟基苯甲酸、赖氨酸和阿拉伯糖醇等22种代谢产物聚为一类,表明辽粳433糙米中代谢产物的相对含量低于越光糙米。这一组中与营养相关的代谢产物有阿拉伯糖醇、亚油酸、肌醇-4-磷酸、瓜氨酸、赖氨酸、N-乙酰-D-己糖胺和苯乙酰胺等。其他42种代谢产物归为一类,表明辽粳433糙米中代谢产物的相对含量高于越光。这一组中与营养相关的代谢产物包括氨基葡萄糖酸、半乳糖醛酸、半乳糖酸、海藻糖-6-磷酸、山酸、三糖、木糖、纤维二糖、帕拉金糖、α-生育酚、泛酸、肌醇、油酸、Β-丙氨酸、4-氨基丁酸、鸟氨酸、1, 2, 4-苯三酚、奎尼酸、绿原酸、腐胺、N-乙酰半乳糖胺等。

表1 辽粳433与越光糙米之间差异代谢产物种类与数量Table 1. Different metabolic species and quantity between brown rice of Liaojing 433 and Koshihikari.

2.4 辽粳433和越光糙米之间差异代谢通路分析

代谢通路分析表明(图3),辽粳433和越光糙米的代谢产物之间有11条显著差异代谢通路,包括赖氨酸生物合成、泛酸盐和辅酶A生物合成、苯丙烷生物合成、肌醇磷酸代谢、抗坏血酸和醛酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、β-丙氨酸代谢、嘌呤代谢、酪氨酸代谢、色氨酸代谢和亚油酸代谢。由表2可见,肌醇磷酸代谢、抗坏血酸和醛酸代谢、酪氨酸代谢和苯丙烷生物合成检测到的代谢产物相对含量均表现为辽粳433高于越光。

3 讨论

3.1 辽粳433和越光糙米之间与营养相关的代谢产物分析

图2 辽粳433和越光糙米的差异代谢产物聚类分析的热图Fig. 2. Heat map of cluster analysis on differential metabolites of brown rice between Liaojing 433 and Koshihikari.

图3 辽粳433与越光的糙米差异代谢通路Fig. 3. Differential metabolic pathways between Liaojing 433 and Koshihikari.

代谢组学分析为农产品营养成分表征、差异性分析以及膳食结构优化提供了新的策略。有机酸影响食物的风味[17],辽粳433和越光通过GC-MS分析鉴定出55种有机酸,辽粳433相对含量高于越光的有39种,其中氨基葡萄糖酸、半乳糖醛酸、半乳糖酸、海藻糖-6-磷酸、山酸相对含量分别是越光的23.86、19.97、2.54、8.51和10.79倍。氨基葡萄糖酸是辽粳433和越光之间差异最显著的有机酸,它是功能性食品甜味剂和添加剂[18],也可与三价络离子形成络合物,降低体内血糖[19]。海藻糖-6-磷酸是植物代谢与生长发育的重要信号[20]。半乳糖酸是植物抗坏血酸生物合成途径的重要前体[21],半乳糖醛酸是果胶的主要成分。高纤维饮食可以降低慢性疾病的发病率[22],维持肠道生态环境[23]。低聚糖对人、动物、植物等具有特殊的生理作用[24]。辽粳433糙米中的三糖、木糖、纤维二糖、帕拉金糖分别是越光糙米中的 13.35、3.63、2.53和 3.20倍。阿拉伯糖醇具有保护牙齿的功能,越光糙米中阿拉伯糖醇是433糙米中1.61倍。维生素是人类维持正常的生理功能而必须从食物中获得的一类微量有机物质。辽粳433与越光糙米中差异维生素有6种,辽粳433糙米中α-生育酚、泛酸、肌醇和油酸分别是越光的2.66、2.90、3.54和9.32倍。越光糙米中亚油酸和肌醇-4-磷酸是辽粳433中的2.33倍和2.39倍。高含量的油酸能促进人体脂质代谢[25]、在膀胱癌、乳腺癌和胰岛细胞凋亡等方面[26-27]都有正面作用。α-生育酚是一种有效的抗氧化剂[28],能降低血液中胆固醇水平,α-生育酚作为脂溶性维生素被美国联邦法规认定为安全的食品添加剂[29]。泛酸是人体必需的维生素之一[30]。肌醇是棉子糖家族寡糖的重要前体物质。4-氨基丁酸(GABA)被认为是一种具有生物活性的植物代谢物,在调节血压、改善睡眠、保护肝脏等方面有正面作用[31],GABA大米被认为是具有保健功能的营养米[32]。β-丙氨酸是自然界中存在的唯一一种β型氨基酸,是有益的膳食补充剂,也是世界范围内广受欢迎的运动补充剂[33-34]。瓜氨酸能够抑制运动引起的血氨升高[35]。辽粳433糙米中非必需氨基酸鸟氨酸、瓜氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸分别是越光的3.04、2.36、2.12和2.44倍。赖氨酸作为水稻第一限制性必需氨基酸[36],与蛋白质含量正相关,在一定范围内蛋白质含量与食味品质间呈显著负相关[37-38],辽粳433的赖氨酸仅为越光和辽粳401的一半,本课题组多年测试结果表明辽粳433食味品质分超过同一地区种植的越光[15],这与赖氨酸含量是否有明确的关系需要进一步分析。次生代谢物含量与抗氧化能力呈正相关[39]。本研究共检测到30种次生代谢产物,辽粳433糙米中含量高的有21种,其中辽粳433糙米中的1, 2, 4-苯三酚、奎尼酸、绿原酸、腐胺、N-乙酰-D-己糖胺是越光的 2.37、4.05、2.10、1.46和 2.04。越光糙米中苯乙酰胺是辽粳433的1.77倍。1, 2, 4-苯三酚除具有清除自由基的能力,还可以抑制血红素诱导的红细胞分化[40]。奎尼酸具有极高价值的化工产品,可作为医药中间体[41],还可用于防治登革热病毒感染。因此,推测辽粳433具有成为高食味、高膳食纤维和保健功能大米的潜力。

表2 辽粳433与越光糙米之间差异代谢途径和参与的代谢物Table 2. Different metabolic pathways and involved metabolites between brown rice of Liaojing 433 and Koshihikari.

3.2 辽粳433与越光糙米之间差异代谢通路对营养价值的影响

本研究检测到的参与肌醇磷酸代谢、抗坏血酸和醛酸代谢、酪氨酸代谢和苯丙烷生物合成的代谢产物相对含量均表现为辽粳433高于越光,可以推测,与越光相比,辽粳433糙米中这5个代谢通路更加活跃。植物体中约1/5的次生代谢产物是由苯丙烷类衍生物代谢途径产生的[42],光合作用固定的碳约有20%被导入苯丙烷途径[43]。代谢产物分析表明,辽粳433糙米中次生代谢物相对含量高的种类占次生代谢物总数的76.67%,是否和苯丙烷代谢途径有直接关系有待进一步分析。酪氨酸代谢可以提供必需的微量元素如维生素E等[44]。肌醇磷酸代谢与抗坏血酸和醛酸代谢紧密相连,抗坏血酸具有治疗坏血病、预防癌症、防治贫血、增强人体免疫力等功效[45],在植物体内抗坏血酸合成代谢途径有4条,其中肌醇代谢途径可作为补充途径[46],肌醇是肌醇6-磷酸的合成前体。磷酸肌醇的代谢可能与多个生理过程相关,肌醇6-磷酸是禾谷类作物种子中磷的主要存储方式[47],是生物体内重要的信使分子,也具有明显的抗癌能力[48]。这些代谢途径中间产物绝大部分具有正面营养价值。

大米和人类生活息息相关。了解每一个品种的营养价值为居民的选择提供方便。越光在日本乃至世界具有盛名,我们研究结果表明,辽粳433糙米中的不饱和脂肪酸、膳食纤维,GABA、α-生育酚、泛酸、奎尼酸等含量高于越光,影响了辽粳433的风味、总体营养价值和抗氧化活性。基于 GC-MS方法进行大米的营养价值评价可以为优质水稻品种选育及最终商业化的水稻品种提供理论依据。

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