皂荚刺黄酮提取及食品添加剂对其稳定性的影响

易 佳，王登宇，2，3，滕 琰，雷 丹，朱勇娟，向雄滋，刘 过

（1.怀化学院生物与食品工程学院，湖南怀化 418000；2.民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室，湖南怀化 418000；3.湘西药用植物与民族植物学湖南省高校重点实验室，湖南怀化 418000）

皂荚系豆科苏木亚科的多年生木本植物[1]，其用途非常广泛，全身都可以加以利用，具有很高的经济、药用等方面的价值[2]。皂荚刺为皂荚树的棘刺，又名皂刺、皂角针、天丁等[3]，以极高的药用价值被制药行业广泛应用，具有消肿排脓、祛风杀虫，用于痈疽疮毒初起或脓成不溃之症，以及皮癣、麻风等[4-5]，具有较高的医疗保健作用，药理活性突出[6-8]，是我国传统的中药材。大量研究表明，皂角刺中含有多种化学成分，主要包括黄酮类、酚酸、三萜等结构类型[9-11]，具有良好的抗肿瘤、抗菌、免疫调节等作用[12-13]，其资源丰富、使用方便、疗效确切，日益受到人们的重视。随着对皂荚刺研究和应用的不断扩大，这一天然植物资源被越来越多的人所认可和接受，开发和利用皂荚刺势在必行。

黄酮类化合物通常富含在芸香科、菊科、玄参科等科属植物的种子、根、茎、叶和浆果中[14]，是药用植物中的主要活性成分之一。该类化合物在人体不能直接合成，只能从食品中获得，主要作为食品添加剂或直接应用于食品中增加其保健作用[15-17]。因此，着重从应用角度来研究食品添加剂对皂荚刺黄酮稳定性的影响，使其作为一种天然可利用资源在食品工业中发挥更大作用，并提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

皂荚刺，采摘于湖南省怀化市新晃侗族自治县；芦丁标准品，国药集团化学试剂有限公司提供；无水乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、硫酸镁、硫酸钙、硫酸锌、硫酸亚铁、硫酸铜，均为分析纯，湖南汇虹试剂有限公司提供；甜味剂、酸味剂、鲜味剂、防腐剂、食盐，食品级。

1.2 仪器与设备

L5型紫外分光光度计，上海精科实业有限公司产品；KQ-250DA型超声仪，昆山舒美超声仪器有限公司产品；高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司产品；RE-52A型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器有限公司产品；DHG-9015A型电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 皂荚刺黄酮的提取工艺

皂荚刺，除杂清洗，自然晾干后于烘箱中60～65℃条件下烘干至水分含量6%，粉碎过40目筛，皂荚刺粉末置于干燥器中备用。取2 g皂荚刺粉末于锥形瓶，加入一定料液比的蒸馏水；浸湿皂荚刺粉末，超声辅助处理一定时间[18-19]，在一定温度、时间下回流，抽滤，滤渣在相同条件下二次回流；再抽滤，合并2次滤液，离心，即得黄酮样液。

1.3.2 皂荚刺黄酮提取单因素试验

（1） 料液比的选择。取2.0 g皂荚刺粉末，按照1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，1∶70的料液比浸湿，在室温条件下以250 W的超声功率处理10 min，然后于70℃下水浴回流40 min。

（2） 提取时间的选择。取2.0 g皂荚刺粉末，按照1∶60的料液比浸湿，在室温条件下以250 W的超声功率处理10 min，然后分别于70℃下水浴回流20，40，60，80，100 min。

（3） 提取温度的选择。取2.0 g皂荚刺粉末，按照1∶60的料液比浸湿，在室温条件下以250 W的超声功率处理10 min，然后分别于60，70，80，90，100℃下回流60 min。

（4） 超声时间的选择。取2.0 g皂荚刺粉末，按照1∶60的料液比浸湿，在室温250 W的超声条件下处理5，10，15，20，25 min，然后于90℃下回流60 min。

1.3.3 皂荚刺黄酮提取正交试验

在单因素试验结果的基础上，对料液比、提取时间、提取温度和超声时间4个因素进行四因素三水平的正交试验。

正交试验因素与水平设计见表1。

表1 正交试验因素与水平设计

1.3.4 黄酮含量的测定

（1）芦丁标准曲线的绘制。精确称取干燥至恒质量的芦丁标准品20.0 mg于100 mL容量瓶中，用70%的乙醇溶解、定容，制成质量浓度为200μg/mL的芦丁标准溶液。分别取质量浓度为0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL 200μg/mL的芦丁标准溶液于10 mL容量瓶中。依次滴加体积分数70%乙醇1 mL，加入质量分数5%亚硝酸钠溶液0.4 mL，摇匀，放置6 min；加入质量分数10%硝酸铝溶液0.4 mL，摇匀，放置6 min；再加入4%氢氧化钠2 mL，加水至刻度，摇匀，放置15 min。于波长510 nm处测定吸光度，以芦丁对照品溶液质量浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制芦丁标准曲线[20-21]。

（2）黄酮含量的测定。准确吸取样品黄酮溶液1 mL于10 mL容量瓶中，采用Al(NO3)3-NaNO2-NaOH系统显色法于波长510 nm处测定吸光度，带入回归方程并计算黄酮提取率（%，以芦丁计）。

式中：C——测得的吸光值由标准曲线计算而来的浓度，μg/mL；

n——样品稀释倍数；

V——浸提液的总体积，mL；

m——提取所用的皂荚刺粉末的质量，g。

1.3.5 食品添加剂对皂荚刺黄酮溶液稳定性的影响

（1）甜味剂对皂荚刺黄酮稳定性的影响。将提取液分别配制成质量分数为1.0%，2.5%，5.0%，7.5%，10.0%的葡萄糖、蔗糖、果葡糖浆、甜蜜素和糖精钠溶液，摇匀，静置后于波长510 nm处测定吸光度。

（2） 酸味剂对皂荚刺黄酮溶液稳定性的影响。将提取液分别配制成质量分数为0.10%，0.25%，0.50%，0.75%，1.00%的柠檬酸、乳酸、苹果酸、酒石酸和富马酸溶液，摇匀，静置后于波长510 nm处测定吸光度。

（3） 鲜味剂对皂荚刺黄酮溶液稳定性的影响。将提取液分别配制成质量分数为0.10%，0.15%，0.20%，0.25%，0.50%的谷氨酸钠、琥珀酸二钠、5'-鸟苷酸二钠、5'-肌苷酸二钠溶液，摇匀，静置后于波长510 nm处测定吸光度。

（4）防腐剂对皂荚刺黄酮溶液稳定性的影响。将提取液分别配制成质量分数为0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%的苯甲酸钠、山梨酸钾、丙酸钠、双乙酸钠溶液，摇匀，静置后于波长510 nm处测定吸光度。

（5）食盐对皂荚刺黄酮溶液稳定性的影响。将提取液配制成质量分数为1.0%，2.5%，5.0%，7.5%，10.0%的食盐溶液，摇匀，静置后于波长510 nm处测定吸光度。

（6）金属离子对皂荚刺黄酮稳定性的影响。取样液9.0 mL，分别加入1.0 mL浓度为0.1～2.0 mol/L的 MgSO4、CaSO4、ZnSO4、FeSO4、CuSO4溶液，一份加入1.0 mL蒸馏水作为对照，观察提取液颜色变化及有无沉淀产生。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

以芦丁标准品溶液质量浓度（X）为横坐标，吸光度（Y）为纵坐标，获得芦丁标准曲线的回归方程为：Y=0.009 9X-0.003（R2=0.999 3），式中Y为吸光值，X为溶液质量浓度，R2为相关系数，芦丁在0～24μg/mL内呈良好的线性关系。

芦丁标准曲线见图1。

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 料液比对黄酮提取率的影响

料液比对黄酮提取率的影响见图2。

由图2可知，当料液比达到 1∶60（g∶mL）时，皂荚刺黄酮的提取率最高，随着提取液增加，总黄酮提取率反而降低，随后总黄酮提取率的变化不大。这是因为溶剂用量适当地增加，可加速黄酮的扩散运动，从而使黄酮提取率变大，但是当提取溶液的用量过高时，很多溶于该提取液的其他成分也大量溶出，阻碍了黄酮的溶出[22]。因此，选择料液比 1∶60 （g∶mL） 为宜。

2.2.2 提取时间对黄酮提取率的影响

提取时间对黄酮提取率的影响见图3。

由图3可知，当提取时间达到60 min时，皂荚刺总黄酮的提取率最高，当提取时间超过60 min时，皂荚刺黄酮的提取率逐渐降低。随着提取时间的增加，被提取出来的黄酮类化合物可能因不稳定而分解导致提取率降低[22]。因此，选择提取时间60 min为宜。

2.2.3 提取温度对黄酮提取率的影响

提取温度对黄酮提取率的影响见图4。

由图4可知，皂荚刺黄酮的提取率随着温度的升高而增加，而当温度超过90℃时，总黄酮的提取率开始下降。这是由于温度升高加速了黄酮类化合物的溶出，使得其提取率逐渐增加，但当超过90℃，温度过高加速了溶剂的挥发进而影响了该植物中黄酮类化合物的提取效果，或者提取过程中提取温度过高可能会破坏分子结构，导致提取率降低[22-23]。因此，选择提取温度90℃为宜。

2.2.4 超声时间对黄酮提取率的影响

超声时间对黄酮提取率的影响见图5。

由图5可知，皂荚刺黄酮的提取率在超声时间为10 min时，黄酮提取率最高，超过10 min，黄酮含量下降。由于超声能产生强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应和搅拌作用，加速了有效成分溶出，当时间过长时，黄酮可能遭到破坏[24-25]。因此，选择超声时间为10 min为宜。

2.3 正交试验结果与分析

正交试验见表2。

表2 正交试验

由表2可知，影响皂荚刺黄酮提取率的因素主次顺序为提取温度（C） ＞提取时间（B） ＞超声时间（D） ＞料液比（A）；试验的最优组合为A2B3C1D3，即皂荚刺黄酮提取率的最优提取工艺为料液比1∶60，超声时间15 min，于80℃下水浴回流80 min，按照优化工艺进行验证试验，皂荚刺中黄酮提取率为4.57%，说明优选的提取工艺稳定可行。

2.4 食品添加剂对皂荚刺黄酮溶液稳定性的影响

2.4.1 甜味剂对皂荚刺黄酮溶液稳定性的影响

甜味剂对黄酮溶液稳定性的影响见图6。

由图6可知，甜味剂质量分数从1%到10%时，对皂荚刺黄酮溶液的稳定性影响结果为葡萄糖、糖精钠对皂荚刺黄酮的稳定性影响小；蔗糖、果葡糖浆和甜蜜素对皂荚刺黄酮的稳定性影响大，当质量分数＞1%时，稳定性影响明显增大。

2.4.2 酸味剂对皂荚刺黄酮溶液稳定性的影响

酸味剂对黄酮溶液稳定性的影响见图7。

由图7可知，酸味剂中柠檬酸、苹果酸和酒石酸对皂荚刺黄酮溶液的稳定性影响不大；乳酸和富马酸对皂荚刺黄酮溶液的稳定性影响很大；当质量分数大于0.25%时，不稳定现象越来越明显，尤其富马酸影响最大，富马酸黄酮溶液有明显浑浊、白色沉淀现象。

2.4.3 鲜味剂对皂荚刺黄酮溶液稳定性的影响

鲜味剂对皂荚刺黄酮溶液稳定性的影响见图8。

由图8可知，谷氨酸钠、琥珀酸二钠对皂荚刺黄酮溶液的稳定性良好；5'-鸟苷酸二钠和5'-肌苷酸二钠随着质量分数的增加，对皂荚刺黄酮溶液稳定性有较大影响。

2.4.4 防腐剂对皂荚刺黄酮溶液稳定性的影响

防腐剂对皂荚刺黄酮溶液稳定性的影响见图9。由图9可知，山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钠和双乙酸钠4种防腐剂对皂荚刺黄酮溶液的稳定性影响不大，从低质量分数到高质量分数黄酮溶液较稳定。

2.4.5 食盐对皂荚刺黄酮溶液稳定性的影响

食盐对皂荚刺黄酮溶液稳定性的影响见图10。

由图10可知，食盐对皂荚刺黄酮溶液的稳定性影响较小。在质量分数＜1%时，溶液吸光值基本无变化；在质量分数＞1%时，溶液稳定性稍稍变差，但不显著。

2.4.6 金属离子对皂荚刺黄酮溶液稳定性的影响

金属离子对黄酮稳定性的影响见表3。

由表3可知，皂荚刺黄酮溶液对Zn2+是稳定的，对 Fe2+、Ca2+、Cu2+不稳定。

3 结论

水浴回流提取皂荚刺黄酮，优化得出最佳提取工艺为料液比1∶60（g∶mL），超声时间15 min，提取温度80℃，提取时间80 min，此条件下皂荚刺黄酮提取率为4.57%。稳定性试验结果表明，葡萄糖、糖精钠、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、谷氨酸钠、琥珀酸二钠、山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钠、双乙酸钠、食盐、Zn2+对皂荚刺黄酮溶液的稳定性影响小；而蔗糖、果葡糖浆、甜蜜素、乳酸、富马酸、5'-鸟苷酸二钠、5'-肌苷酸二钠、Fe2+、Ca2+、Cu2+对皂荚刺黄酮溶液的稳定性影响较大。

皂荚刺水浴提取成本低、操作方便，研究其稳定性，为今后黄酮应用于食品加工与开发中，减少食品添加剂对黄酮的破坏，保留其在食品中的功效，具有积极意义。

表3 金属离子对黄酮稳定性的影响