一起巴西龟引起幼儿长湾泥沙门菌感染的调查研究

童 晶，吴畏畏，张传皊，郭 惠，郑东宇

长湾泥沙门菌于1955首次报道[1]，国内于2016年才首次有检出报道[2]，是腹泻人群中较罕见病原菌型。相关文献中有10起长湾泥沙门菌感染都与宠物乌龟接触有关[3]。2018年9月于徐州市儿童医院1例出血性腹泻幼儿的血液标本中检出长湾泥沙门菌(SalmonellaJangwani,17∶a∶1.5),系江苏地区首次检出。随后，对患儿进行流行病学调查和暴露因素病原学检索，对阳检菌株的生物学特征和分子流行病学特征进行研究，为感染溯源提供生物学证据。现将研究结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 资料来源

1.1.1病例标本 2018年9月10日徐州市儿童医院住院收治出血性腹泻幼儿1例，采集1份静脉血5 mL和1份血样大便3 g。

1.1.2暴露因素样本 2018年9月27日采集患儿家中婴儿奶粉，米粉，薯片各1份(50 g/份)，餐具涂抹样2份(100 cm2/份)，巴西龟粪便1份，巴西龟壳和容器涂抹标本各1份(100 cm2/份)，共计8份标本进行病原学检测。并于10月、11月连续进行龟粪便、龟容器、龟壳采样，共采集标本6份。

1.2 主要试剂和仪器

1.2.1仪器 ATB Expression 自动细菌鉴定仪由法国梅里埃公司提供；CHEF-mapper型脉冲场凝胶电泳仪及配套设备为美国伯乐公司；美华MA120鉴定药敏分析系统为珠海美华公司提供。

1.3 方 法

1.3.1流行病学调查 及时查阅患儿就诊记录和跟踪回访，对高危因素进行连续跟踪调查监测。

1.3.2病原学检测 按照《GB 4789.4-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门菌检验》、《全国食源性疾病监测工作手册》进行沙门菌的分离、鉴定、血清学分型等病原学表型检测。

1.3.3抗生素敏感性试验 采用国家致病菌识别网推荐的微量肉汤稀释法检测沙门菌对27种抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)。抗生素包括：氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、四环素、氯霉素、复方新诺明、头孢唑啉、头孢噻肟、头孢他啶、头孢西丁、庆大霉素、亚胺培南、萘啶酸、阿奇霉素、磺胺异恶唑、环丙沙星、阿莫西林/克拉维酸、多粘菌素E、多粘菌素B、米诺环素、阿米卡星、氨曲南、头孢吡肟、美罗培南、左氧沙星、多西环素、卡那霉素、链霉素。标准质控菌株大肠埃希菌ATCC 25922作为药敏试验质控菌。操作、质量控制、结果判读均严格按照美国临床实验室标准化委员会(CLSI M100-S27)抗微生物药物敏感性试验执行标准(2017年)执行。

1.3.4PFGE 分型方法 参照国家致病菌识别网技术手册(分子分型实验篇)标准操作程序进行XbaⅠ和BlnⅠ双酶切PFGE，结果采用BioNumerics(Applied—maths公司ver6.6)进行分析处理，采用UPGMA法进行聚类分析。

2 结 果

2.1 流行病学调查

2.1.1临床表现及诊治过程 患儿，男，1岁3个月，2018年9月4日发病，以黄色、粘液便为主，5～6次/d，无发热、呕吐，给予蒙脱石散，妈咪爱对症治疗，效果差。9月8日，发热38.7 ℃，血便，遂至当地镇医院输液治疗，出现大量血便，后转入徐州市儿童医院住院治疗。入院各项检查指征为：超敏C反应蛋白49.23 mg/L；白介素-6:13.25 pg/mL；血常规:白细胞7.62×109/L,红细胞4.44×1012/L,血红蛋白113 g/L,中性细胞比率50.2%，淋巴细胞比率37.5%，单核细胞比率12.2%。大便常规：RBC 6～8/HP,WBC 20～25/HP,潜血++。其余各项未见明显异常。患儿血培养显示肠沙门氏菌亚种。予头孢曲松联合哌拉西林/他唑巴坦抗感染治疗，好转。

2.1.2感染来源调查 回顾性家访调查确认，患儿以人工喂养、奶粉喂养为主，辅以薯片和米粉，近期家庭其他成员无不适，患病前1周无外出就餐和旅游史。家中饲养1只巴西龟1年余，经常有龟壳接触史。

2.1.3连续跟踪随访 根据调查结果，告知患儿家长做好隔离防护，避免患儿再次接触巴西龟和其他高危因素，2018年9-11月随访期间，患儿未曾出现二次感染，期间每个月采集巴西龟样品进行监测。

2.2 病原学检测

2.2.1病原学监测结果 在患儿发病6 d后，收治住院的2份患儿标本中，仅在血培养中检出1株长湾泥沙门菌，患儿血便中未有检出。在食品、餐具、龟粪等共计14份暴露因素样品中有4份样品检出长湾泥沙门菌。在新鲜龟粪和龟壳涂抹样品中有检出，详见表1。

表1 长湾泥沙门菌暴露因素样本连续监测结果Tab.1 Results of continuous monitoring in samples of Salmonella Jangwani exposure factors

2.2.2生化表型鉴定 5株阳检菌在科玛嘉沙门菌显色平板36 ℃培养 24 h，呈现紫红色、圆形湿润的菌落特征；经革兰染色镜检见革兰阴性无芽孢杆菌；挑选选择性平板生长的疑似典型菌落接种于双糖铁琼脂，36 ℃培养 24 h，结果为斜面产碱，底层产酸(K/A)，产气，H2S+。经API 20 E进行系统生化鉴定，生化编码为6705752，鉴定结果为沙门菌属(id=99.9%)。5株菌株生化谱完全一致，结果见表 2。对血液来源菌株，同时用vitek GN板条进行验证，鉴定结果一致，生物编码为00176105455666(95%概率)。

2.2.3血清学鉴定结果 5株菌株分别用宁波天润沙门菌血清进行初步鉴定，然后用丹麦 SSI 沙门菌血清进行复核。根据 Kauffman-White 血清分型标准，血清型别判定为长湾泥沙门菌血清型(SalmonellaJangwani，17∶a∶1，5)。经江苏省疾病预防控制中心用丹麦SSI沙门菌血清复核鉴定结果为符合。

2.2.4药敏试验结果 本次分离的5株长湾泥沙门菌，4株菌的耐药谱100%一致，仅对头孢唑啉耐药有差异：18-Q4-4为中介，其它4株菌株为耐药。5株菌均对磺胺异恶唑耐药，对四环素中度耐药，对其他25种药物均敏感，详见表3。

表2 长湾泥沙门菌API 20E生化谱Tab.2 Biochemical Spectrum of Salmonella Jangwani API 20E

表3 5株长湾泥沙门菌药敏实验结果Tab.3 Result of drug sensitivity test of 5 strains of Salmonella Jangwani

2.2.5PFGE分型结果 5株沙氏菌经XbaⅠ和BlnⅠ双酶切，带型相似度均达到100%，提示不同来源的长湾泥沙门菌均来自1个生物克隆，患儿分离株与龟粪便株高度同源，见图1。

3 讨 论

长湾泥沙门菌感染在2016年和2017年分别在浙江和北京有相关报道[2，4]，江苏及周边地区未见相关研究。本次分离到的长湾泥沙门菌在徐州地区为首次检出。浙江和北京病例未对病原菌传播进行溯源或未能溯源到，而本研究中对病人分离株和巴西龟宠物分离株实现了良好的生物学溯源。巴西龟和患儿样品中检索的长湾泥沙门菌生物表型特征高度一致，PFGE分型分析表明，不同来源的分离株来自于同一生物克隆，提供了有力的分子流行病学证据。同时流行病学调查结论也一致支持巴西龟为患儿长湾泥沙门菌感染的来源。

在90年代初期，国外研究人员已经从外来宠物感染沙门菌案例中分离出包括乙型副伤寒爪哇变种、斯坦利、浦那、长湾泥、利奇菲尔德、曼哈顿、波摩那、迈阿密等多种沙门菌血清型[5]。爬行动物成为人感染沙门菌的主要来源，其粪便带菌率超过90%[6]。本研究连续监测证实，巴西龟作为传染源可以连续带菌，但是病原菌在体外存活能力不强，在陈旧龟粪中未有检出。

流行病学调查显示，患儿年龄较小，经常接触宠物龟，对于接触后是否及时洗手或是直接饮食，家长未能及时关注，因此发病初期可能存在二次感染，从而使患儿出现继发感染——菌血症。当病家意识到巴西龟的危害后，做好隔离，随访3个月期间患儿未曾二次感染。宠物巴西龟由于饲养方便，受到很多儿童家庭的喜爱，但是外来宠物物种有病原感染风险，需引起众多儿童家庭的重视。

本次分离到的长湾泥沙门菌常用抗菌药物尚保持敏感,对磺胺类药物耐药，故患儿在使用头孢曲松联合哌拉西林/他唑巴坦抗感染治疗后，效果明显。提示相关感染防治重点是关注传染源，做好二次感染防护。

图1 5株不同来源长湾泥沙门菌双酶切PFGE聚类分析图谱Fig.1 PFGE cluster analysis of 5 strains of Salmonella Jangwani from different sources

爬行动物的肠道适合某些沙门菌定植，多种沙门菌血清型陆续从巴西龟、蜥蜴等宠物中分离到[7]，流行病学调查也表明感染者曾接触过此类动物，因此，沙门菌的感染高危人群，即免疫力低下者、老人、幼儿或婴幼儿看护人员，应避免接触此类爬行动物。而一些宠物售卖者或批发商在宠物预防性治疗上，开始使用抗生素，促使沙门菌耐药克隆的增加，从而导致在人类疾病出现时，不再对抗生素治疗有效或出现沙门菌重症感染，从而引发新型耐药菌型的出现。由于我国对爬行类动物携带感染人的致病菌的研究尚不丰富，因此，需要警觉该类传染病的潜在上升趋势和被低估的可能。

本研究中，由于病家巴西龟购买时间过久，未能溯查到巴西龟的销售来源，因此其他购买者的家庭是否也有感染病例出现，是否去医院就诊不得而知。另外，此次调查涉及的标本量较少，时间尚短，因此，以后研究需要加大对爬行类宠物感染人的病原学监测，收集更全面的数据，为新发传染病的防控提供基线预警资料。

利益冲突：无