吕燕宁,陈丽娟,李仁清,孙玉兰,陈艳伟,王全意
北京市预防医学研究中心科研项目培育专项(No.2015-BJYJ-08)
布鲁氏菌病(Brucellosis,简称布病)是由布鲁氏菌侵入机体而引起的一种世界范围流行的人兽共患传染病。人间布病为我国法定的乙类传染病[1]。近年来全国布病疫情呈现逐年上升趋势[2],防控形势十分严峻[3]。对布病病人进行正确、合理、及时的治疗,同时追溯感染来源并对传染源进行有效控制是布病防控中的重要环节。
布病的临床表现多种多样,而且许多症状没有特异性,患病早期有发热、出汗、浑身疼痛等症状,类似普通感冒或流感样表现[4]。还有一些病人出现肝脾肿大、黄疸等表现,需要与病毒性肝炎相鉴别[5]。由于布鲁氏菌致病的特殊免疫病理机制,布病在临床上存在复发与重复感染,病人会出现二次或多次发病的现象。首次患布鲁氏菌病后,在传染源存在的情况下,可以再次或多次患病,除部分为复发外,不能排除二次感染发病[6]。对于二次或多次就诊的患者而言,患者主诉多为乏力、出汗、肌肉关节疼痛,布病抗体检测又一直呈阳性,所以临床医生很难分清患者是普通感冒,是风湿性关节炎,还是布病复发或是重复感染[7]。急性期布病患者治愈后又重新发病,是复发还是重复感染而再次生病,这是目前临床上很难用实验室手段来区分的,因为大多数布病患者血液中的抗体可以持续多年,且滴度较高。用血清学检测难以区分复发或重复感染[7]。对于布病的复发与重复感染,在患者的临床处置以及公共卫生领域的传染病疫情处置程序上均有不同,对于布病复发患者重在关注临床治疗,要考虑感染病原是否耐药,是否需要改变治疗方案以及患者对于治疗的依从性如何等问题。而对于重复感染的患者则需考虑是否以及如何再次接触了传染源,并应及时采取措施控制或消除传染源,切断传播途径等。因此对这两种情况的科学判断不仅能给与布病患者以明确的诊断,为临床用药提供理论依据,对指导临床合理用药,减少过度治疗和药物毒副作用对人体的伤害,降低药物异常反应的发生率[7],有着指示性作用,对于及时追溯与控制传染源,控制布病的流行也具有重要意义。
本文旨在探索利用布鲁氏菌多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)的分子分型方法对布病的复发与重复感染来进行鉴别。
1.1样本及其病例基本信息 2014-2015年在北京某医院收集了4例布病患者先后两次发病后的血培养阳性样本共8份。通过中国疾病预防控制信息系统以及医院接诊记录收集病例的基本信息。
1.2主要试剂与仪器 Platinum PCR SuperMix(美国Invitrogen公司,货号11306-016),哥伦比亚血平板培养基(英国OXOID公司,货号PB0123A),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;核酸自动电泳用卡夹(QIAxcel DNA Screening Kit)与QX Alignment Marker 15 bp/3 kb(德国QIAGEN公司,货号分别为929004和929522),100 bp DNA Marker(美国NEB公司,货号为N3231L)。
毛细管电泳仪QIAXCEL(德国QIAGEN公司),iCycler普通PCR仪(美国Bio-Rad公司),数控干浴器AccuBlock(美国Labnet公司),货号为D1100。数字振荡培养箱(美国Labnet公司)。
1.3菌株分离及其DNA制备 将血培养阳性样本接种于哥伦比亚血平板,置于37 ℃生化培养箱,培养72 h后,刮取1~2接种环菌苔加入150 μL三馏水中,振荡混匀制成菌悬液,100 ℃煮沸10 min;12 000 r/min离心10 min,取上清液于-20 ℃冰箱中保存备用。
1.4布鲁氏菌属及种/型鉴定 采用BCSP31-PCR法进行布鲁氏菌属的鉴定,采用AMOS-PCR法进行布鲁氏菌种/型的鉴定,引物序列及PCR方法参见文献[8]。
1.5菌株的MLVA-16分型鉴定 共选取16个VNTR位点进行PCR扩增,PCR引物序列及荧光标记参见文献[9],具体见表1。采用二重聚合酶链反应技术(PCR)扩增各VNTR位点。反应体系:8套二重PCR均采用25 μL反应体系,其中Platinum PCR SuperMix预混液21 μL,2对混合引物(10 μm)2 μL,模板2 μL。扩增条件:预变性95 ℃ 4 min,变性95 ℃ 30 s,退火60 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s,35个循环,最后72 ℃ 7 min延伸。扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行STR(short tandem repeat)检测,确定片段大小,计算该片段的重复单元数。逐个计算菌株每个位点的串联重复序列数目;将每个菌株的16个位点的串联重复序列数目输入到布鲁菌MLVA数据库http://mlva.u-psud.fr/mlvav4/genotyping/index.php中进行比较,确定菌株基因型别。
2.14例病例的基本信息 见表2。
2.2菌株分离及其布鲁氏菌属及种/型鉴定结果 4个病例两次发病的采样时间及其血培养报阳时间见表3,血培养报阳后将培养物接种血平板分离培养3 d得到菌株。8株菌经BCSP31-PCR扩增后,均出现223 bp条带,鉴定为布鲁氏菌。扩增结果见图1。8株菌经AMOS-PCR扩增后,均出现178/731 bp大小的目的条带,鉴定为羊种布鲁菌。扩增结果见图2。
表1 MLVA-16分型引物Tab.1 Primers for MLVA-16 genotyping
表2 病例基本信息Tab.2 Basic information of the cases
表3 病例两次发病采样时间与血培养报阳时间Tab.3 Sampling time and blood culture positive report time in two onset of the cases
S1-S8为编号S1至S8的菌株,M为NEB 100 bp Marker。图1 S1-S8菌株BCSP31-PCR扩增结果Fig.1 BCSP31-PCR amplification results of S1-S8 strains
S1-S8为编号S1至S8的菌株,M为NEB 100 bp Marker。图2 S1-S8菌株AMOS-PCR扩增结果Fig.2 AMOS-PCR amplification results of S1-S8 strains
2.3分离菌株的MLVA-16分型鉴定结果 8株菌按照每个位点上能够扩增出的基因片段大小及其重复片段的大小换算重复片段的个数见表。MLVA-16分型的Panel 1包括8个位点:Bruce06、08、11、12、42、43、45、55,Panel 2A包括3个位点:Bruce18、19、21,Panel 2B包括5个位点:Bruce04、07、09、16、30。结果显示,变异最大的位点是Panel 2B的Bruce04,其次为Panel 1的Bruce43位点和Panel 2B的Bruce16位点。通过MLVA-16分型方法可将8株布鲁氏菌分为7种不同的基因型,在数据库中均不能找到完全对应的基因型,故自定义为1-7型。按照Panel 1的结果分型可分为3种基因型:3个基因型均在数据库中存在,分别为42(1-5-3-13-2-2-3-2,N=4),63(1-5-3-13-2-3-3-2,N=2),114(1-5-3-13-2-1-3-2,N=2),各菌株16个位点的重复单元个数见表4。结果显示,4个病例中有1例两次发病时间间隔较短的患者的两株分离菌株的MLVA-16分型完全一致,提示为复发。另外3例两次发病时间间隔较长的病人前后两次发病分离到的菌株的MLVA-16分型是不同的,分别各有一个位点的差异,其中两位病人的差异在Bruce04位点,1例病人的差异在Bruce16位点。
表4 8株布鲁菌分离株MLVA-16基因分型Tab.4 MLVA-16 genotyping of 8 Brucella isolates
在很多国家,布病都被认为是重大公共卫生问题。尽管该病的病死率极低,但严重威胁着动物饲养、兽医、肉品加工等从业人员的身体健康,并给畜牧生产造成重大损失,还会影响旅游业及国际贸易的发展[10]。
人感染布鲁氏菌可累及全身多个组织器官,临床表现为发热、多汗、乏力、关节肌肉疼痛等,急性期可以治愈,但不易被确诊,常迁延为慢性感染,慢性期布病患者可有肝、脾及睾丸肿大,关节和脊柱强直,肌腱挛缩变硬等,很难治愈,如引起脑炎和心肌炎者可致命,严重影响人类健康[8]。由于布鲁氏菌感染机体后特殊的免疫病理反应,布病患者存在复发和重复感染的现象。而鉴别复发和重复感染,无论是对指导布病患者的治疗,还是对布病患者的感染来源进行追溯和管理都具有重要的意义。
目前临床上布病的检测主要使用血清学检验技术,诊断也主要依赖于血清抗体的检测结果。但血清学检测方法无法鉴别复发和重复感染,也无法对布病进行病原学分型以及感染来源的追踪溯源。人布鲁氏菌病诊断的金标准是从感染者的血液或者其他临床样本中分离出布鲁氏菌,对分离的病原进行病原学特征的分析对病人的诊断具有重要意义。目前布鲁氏菌的分型方法有很多种,各有优缺点。MLVA分型由于具有快速、操作简单、成本低廉、重复性好的优点,可鉴别到生物型水平,且便于实验室之间进行比较等特点,使用较为广泛。MLVA分型方法由Le Fleche等[11]提出,方案是对15个位点进行分析。之后,Al-Dahouk等人在此基础上增加了Bruce19位点[12],将其调整为16个位点。其中Panel 1包括Bruce 06、08、11、12、42、43、45和55共8个位点,适用于布鲁氏菌种间比较;Panel 2A包括Bruce 18、19和21共3个位点,Panel 2B包括Bruce 04、07、09、16和30共5个位点,Panel 2适合用于基因型的比较。
Garcia-Yoldi D等[13]研究认为,MLVA是唯一一种能揭示布病暴发和确定储存宿主的方法。该方法还可作为流行病学调查的工具,用来确定传染源及传播途径,并找到菌株之间的关联[14],通过对菌株进行聚类分析,得知感染来源是否相关[15]。本研究利用MLVA-16的分型方法对来源于4例先后两次发病的布病患者的8株分离菌株进行鉴定分析,探索该方法对布病复发和重复感染的鉴别诊断意义。
本研究首先采用BCSP31-PCR方法确定了8株分离菌株均为布鲁氏菌;通过AMOS-PCR方法确定了其均为羊种布鲁氏菌。再通过MLVA-16方法将收集到的8株菌株分为了7种基因型。没有任何一株可以和布鲁氏菌MLVA数据库中的菌株相匹配。我们认为这主要是由于数据库中的大部分数据都是由外国学者研究、上传的。因不同地区,不同地域流行的布鲁氏菌菌株不同,因此出现了基因型没有对应的情况,且从20世纪60年代中期至今,北京地区未曾系统开展布病细菌学方面的研究工作,布病的病原学资料为空白。因此确实存在北京地区布鲁菌菌株和其他地区区别较大的可能。此外,没有在数据库中找到相对应的菌株也从另一方面说明北京地区的布鲁氏菌型别的分布和其他地区可能存在较大的区别[16]。
MLVA-16结果分析显示,8株菌Panel 2B的Bruce04位点VNTR个数的变化最大,该位点多样性最高,其分辨率也最高。其次是Panel 1的Bruce43和Panel 2B的Bruce16位点,而其他位点多样性较低,这与很多研究结果一致[17-21]。1、3、4号患者于不同时间、两次发病后分离的菌株S1和S2、S5和S6、S7和S8 6株菌株的MLVA-16分型均不同。S1和S2、S5和S6、S7和S8各分别相差1个位点,提示患者二次发病为重复感染,而非复发。而2号患者的前后两次发病分离到的菌株MLVA-16分型完全一致,提示该患者的再次发病为复发,Kilic S.等人的研究也认为同一患者初次发病与复发分离到的菌株,其MLVA-16的分型是一致的[22]。有研究显示布病复发多发生在首次发病治愈后的半年之内[6],而2号患者两次发病的时间间隔为112 d,在3~4个月之间,也提示其二次发病为复发而非重复感染。1、3、4号患者的二次发病时间分别为237、276和234 d,为8~9月左右,两次发病的时间间隔较长,这也提示其二次发病为重复感染的可能性较大。有研究认为首发布病以发烧、发冷、出汗、头痛、头晕症状为主,关节疼痛症状较轻,复发性布病的临床症状则与前者相反[6]。也有学者认为复发为布病的慢性化,而重复感染则为急性布病的表现,二者在实验室检查上很难做鉴别,但二者的临床表现是有明显不同的,临床医生需要对就诊的布病患者进行详细深入的询问,耐心细致的检查,才会在相关的症状、体征上发现一些差别,从而做出鉴别[7]。本研究的结果表明,如果能够从患者体内分到病原,结合临床表现,发病时间间隔、以及流行病学史等多方面的信息,对分离株的病原学特征进行分析有助于对布病的复发和重复感染进行鉴别诊断,MLVA-16分型方法对不同菌株之间的差异具有较高的分辨率,可作为布病复发和重复感染鉴别诊断的有效手段之一。
利益冲突:无