重庆市库蚊标本中宜昌病毒的分离鉴定

李 樊，付士红，何小周，何亚明，叶 盛，邵 楠，殷启凯，赵洁荣，冯盼盼，禄 阳，陈晓菁，何 英，凌 华，马学军，梁国栋，许松涛，王环宇

重庆市位于中国内陆西南部、长江上游地区，长江横贯其全境。面积8.24万km2，辖38个区县(26区、8县、4自治县)。地貌以丘陵、山地为主，有“山城”之称。重庆属亚热带季风性湿润气候，气候温暖湿润、适宜媒介昆虫孳生繁殖。 因气候、环境、地理条件等原因，重庆市一直以来是乙型脑炎的高发地区，因此在当地开展虫媒调查，对于了解当地蚊虫乙脑病毒带毒率及分子遗传特征，了解该地区蚊虫携带病毒的种类及多样性，以及虫媒病毒病的防控都具有重要意义[1-3]。

Yichang病毒是一种昆虫病毒，属于套式病毒目(Nidovirales)Mesoniviridae病毒科，最早于2014年中国湖北省宜昌市采集的蚊虫标本中被分离出来，湖北省多个地区的蚊虫标本中也曾检测到该病毒的核酸[4]。目前，对于该病毒的宿主范围、流行地理范围尚不清晰。本研究对2017年在重庆市开展虫媒病毒调查的过程中从库蚊标本中分离到Yichang病毒进行报道。

1 材料和方法

1.1标本采集 2017年9月初在重庆市巴南区和丰都县的人房和猪圈采用吸入式捕蚊器在晚间5-9点诱捕采集成蚊，当日回收成蚊放置-20 ℃冰箱冷冻30 min，剔除雄蚊并按不同种属对雌蚊分类，30～50只/管装至冻存管，编号后迅速保存于液氮罐中。

1.2细胞培养 实验所用细胞为白纹伊蚊细胞(Aedes albopictus cell，C6/36)、金黄地鼠肾细胞(BHK-21)、非洲绿猴肾细胞(Vero)，由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所保存。C6/36细胞培养液为1640培养基(Gibco)含10%胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS, Gibco)和100 U/mL青霉素和链霉素。 BHK-21、Vero细胞培养液为MEM培养基含10% FBS和100 U/mL青霉素和链霉素。

1.3病毒分离 在生物安全柜内向每支蚊虫标本中，加入1 mL含100 U/mL青霉素和链霉素的MEM培养液, 使用组织研磨机(美国QIAGEN公司)对标本进行研磨, 将研磨后的标本于4 ℃，18 000×g，离心20 min。吸取上清液150 μL用0.22 μmol/L过滤器进行过滤后，接种到已长成70%～80%的单层C6/36、Vero、BHK-21细胞，吸附1 h后，加入1 mL含2% FBS的细胞维持液，分别置于5% CO2培养箱中，逐日观察细胞病变(Cytopathic effects，CPE)情况，当CPE达到75%时收获培养上清液，再次接种细胞；以相同程序盲传3代，有病变的分离物继续进行鉴定分析。

1.4核酸提取及高通量测序 取阳性分离物上清液，用QIAamp viral RNA mini kit(QIAGEN公司)按说明书提取病毒RNA，采用Superscript III反转录酶(Thermo Fisher)和随机引物合成cDNA，采用NEBNext mRNA Second Strand Synthesis Module(美国NewEnglandBiolabs公司)完成第2链DNA合成。再用Nextera XT DNA Library Preparation Kit (美国Illumina公司)完成文库构建。该文库在Qubit 4.0荧光计(Thermo Fisher)定量后，在Illumina iseq平台上进行双端测序(2×150碱基)。 根据平均质量值(Q30)评价测序质量并过滤数据。将过滤后数据拼接生成Contig，在美国国家生物技术信息中心(NCBI)病毒基因组数据库中(http://www.NCBI.nlm.nih.gov)进行BLAST比对。将过滤后数据用useglaxy(https://useglaxy.org/)中的Bowtie 2比对目标基因组，并生成Consensus序列。使用Open Reading Frame Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)预测基因组开放阅读框。获得病毒的全基因序列已提交NCBI基因库，登录号为MT070763。

1.5系统发育分析 使用MAFFT V7(https://www.ebi.ac.uk/Tools/)进行多序列比对。利用NCBI BLAST对测序结果进行核苷酸与氨基酸序列一致性分析。从GenBank中选取与阳性序列相似的参考毒株，用MEGA X构建进化树。

2 结 果

2.1病毒分离 2017年9月，在重庆市巴南区和丰都县共采集到732只蚊虫标本(图1)，其中骚扰阿蚊672只(92%)，致倦库蚊30只(4%)，三带喙库蚊30只(4%)。这些蚊虫被分为20批次接种细胞。从重庆地区丰都县致倦库蚊标本分离物在接种C6/36细胞后72 h开始引起细胞CPE。CPE的主要特征是细胞变圆、皱缩、甚至脱落(图2)，120 h后细胞完全病变。而BHK-21和Vero细胞在3次盲传过程中均未观察到CPE。该分离物被定名为CQFD2017。

地图中重庆市所在区域以浅灰色标识，丰都县和巴南区以深灰色标识。图1 蚊虫标本采集地点Fig.1 Locations where mosquito samplings were performed

2.2CQFD2017基因组序列分析 为鉴定所分离的病毒，对病毒基因组进行高通量测序分析和系统进化分析。 CQFD2017的组装基因组为20 893 bp，3′端含有poly(A)尾。该基因组鉴定出6个开放阅读框：ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、 ORF3a、ORF3b。ORF1a跨越核苷酸317-8 635 nt，并编码2 772个氨基酸；ORF1b跨越核苷酸8 614-16 413 nt，编码2 600 个氨基酸；ORF2a跨越核苷酸16 473-19 181 nt, 编码902个氨基酸; ORF2b跨越核苷酸16 436-17 110 nt，编码224个氨基酸; ORF3a跨越核苷酸19 224-19 709 nt，编码161个氨基酸; ORF3b跨越核苷酸19 534-19 908 nt，编码124个氨基酸; 而5′和3′非编码区的长度分别为316 bp和529 bp。拼接组装获得contig经BLASTx分析表明，它与Mesoniviridae病毒科的Yichang病毒(NC_040534)最为匹配。组装获得的CQFD2017全基因组与Yichang病毒的核苷酸一致性有98.6%，ORF1a和ORF1b区域的氨基酸一致性分别为99.06%和99.15%，CQFD2017与Mesoniviridae病毒科其他成员的的氨基酸一致性在22%～51%之间(表1)。

2.3CQFD2017的系统发育分析 为了研究CQFD2017的系统进化地位，从NCBI 的GenBank下载了与CQFD2017相似性≥30%的RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)氨基酸序列，并用于构建系统发育树。分析表明，CQFD2017属于Mesoniviridae病毒科，为Yichang病毒。CQFD2017与冠状病毒科的形成了不同的进化分支，与Nam Dinh病毒、DaK Nong病毒、Hana病毒等构成了Mesoniviridae病毒科进化簇(图3)。

(A)C6/36细胞对照;(B)CQFD2017感染细胞72 h; (C) CQFD2017感染细胞120 h。比例尺为200 μm图2 CQFD2017对C6/36细胞致病变作用Fig.2 Cytopathic effects (CPEs) caused by CQFD2017 in C6/36 cells

表1 CQFD2017与Mesoniviridae病毒科家族成员的氨基酸序列比对分析Tab.1 Amino acid identities between CQFD2017 and other members of family Mesoniviridae

注：实心圆表示CQFD2017分离株；分支节点上的校验值表示经1000次重构后相应分支出现的概率；隐藏分支节点上小于60%的校验值。图3 基于宜昌病毒分离株CQFD2017的RdRp区氨基酸序列的系统进化分析Fig.3 Neighbor-joining tree inferred from molecular phylogenetic analysis based on the amino acid sequences of CQFD2017 RdRp segments

3 讨 论

套式病毒目(Nidovirales)病毒是一类主要感染哺乳动物, 少数感染禽类及无脊椎动物的有囊膜的单股正链RNA病毒，也是目前已知的含有最长基因组的RNA病毒。根据2016年国际病毒分类委员会对RNA病毒的分类，目前该病毒目包含4个病毒科：动脉炎病毒科(Arteriviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、杆状套病毒科(Roniviridae)及近些年被鉴定出来的(Mesoniviridae)[5]。 以引起蓝耳病的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)为代表的动脉炎病毒科基因组RNA约12.7～15.7 kb，被称作为“小”基因组套式病毒；冠状病毒科(包括SARS病毒、MERS病毒等)、杆状套病毒科的基因组RNA长约26.3～31.7 kb, 被称作“大”基因组套式病毒; 新发现的Mesoniviridae科病毒(Nam Dinh病毒、DaK Nong病毒等)基因组大小位于上述两者之间，被称之为 “中等”套式病毒[6-7]。随着高通量测序技术的发展和应用，越来越多套式病毒目的成员被分离鉴定[4, 8-10]。近年来，Mesoniviridae病毒科成员被从亚洲(越南、泰国、韩国、印度尼西亚和中国)、非洲(科特迪瓦)、大洋洲(澳大利亚)和北美洲(美国)等多地的蚊虫和蝙蝠中分离出来，表明了这类病毒地理分布的广泛性[8, 10-16]。

2017年9月，本课题组在重庆市的巴南区和丰都县开展了虫媒调查，并从丰都县采集的库蚊标本中分离到Yichang病毒CQFD2017株。经对其细胞生物学水平及分子遗传学水平的研究发现，该病毒与2014年袁志明教授团队分离自中国湖北省宜昌市库蚊标本的Yichang病毒为同种病毒，核苷酸序列高度一致达到98.6%[4]。

重庆市和宜昌市均位于长江的干流上，三峡水库位于重庆和宜昌之间，含重庆市22个区县市及湖北省4个县市。而Yichang病毒在2014年和2017年在三峡地区的多次被分离或检测到，表明该病毒在三峡地区自然界的蚊虫中已形成稳定的流行。但前期研究结果显示，该病毒仅能在白纹伊蚊细胞C6/36上引起CPE，而在哺乳动物细胞BHK-21和灵长类细胞Vero上并未观察到CPE。 但与Yichang病毒同属Mesoniviridae病毒科、分离于2002年越南脑炎患者脑脊液中的Nam Dinh病毒已被怀疑是引起人类脑炎的新型病毒。目前对于Yichang病毒在蚊虫间的传播机制及中间宿主的种类尚不明确，该病毒是否能引起人兽疾病尚有待进一步探讨。考虑到该病毒具有引起人兽疾病的潜在风险，未来有必要在三峡地区开展的虫媒监测中持续关注该病毒，跟踪其流行传播趋势及分子遗传变异特征。

(感谢重庆市疾病预防控制中心、巴南区疾病预防控制中心、丰都县疾病预防控制中心的同志在蚊虫标本采集过程中给予的配合和帮助。)

利益冲突：无