吡非尼酮对硬皮病小鼠结缔组织生长因子和V型胶原含量的作用分析

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1.柳州市工人医院风湿免疫科，广西柳州 545005；2.柳州市工人医院呼吸与危重症医学科，广西柳州 545005；3.柳州市工人医院病理科，广西柳州 545005

硬皮病（scleroderma，SD）是一类以小血管病变、免疫异常及皮肤增厚和纤维化为主要特点的自身免疫性疾病，病因及发病机制十分复杂，目前尚未完全清楚，治疗较困难[1]。吡非尼酮（pirfenidone，PFD）具有抗炎、抗氧化作用和抑制胶原的合成，甚至能够逆转纤维化和瘢痕的形成，这在大量的动物和体外实验中被证实[2-3]。PFD能够减少肺、肾等器官成纤维细胞结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）的表达，并与胶原的合成和基质的减少呈相关性[4-5]。PFD作用于皮肤纤维化的机制如何，国内的报道较少。基于此，本研究通过检测给予PFD干预SD小鼠模型后皮肤CTGF和ColV含量的变化，为临床PFD防治皮肤纤维化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

从湖南斯莱克景达实验动物有限公司购买SPF级6～8周龄雌性BALB/c小鼠，共24只，体重（25±2）g，许可证号：SCXK（湘）2016-0002。在通风采光正常的环境中饲养1周后开始实验。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂 博来霉素（Bleomycin，BLM）A（H20055883）和吡非尼酮胶囊（H20133376）分别购自浙江海正药业股份有限公司和北京康蒂尼药业有限公司。磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer solution，PBS）购自福州迈新生物技术开发有限公司，苏木素染液、1%伊红染液、Msson复合染色液均购自珠海贝索生物技术有限公司。羟脯氨酸试剂盒购自南京建成生物工程研究所；多克隆抗体兔抗鼠CTGF抗体为武汉博士德生物工程有限公司产品；多克隆抗体兔抗鼠ColV抗体为北京博奥森生物技术有限公司产品；SP试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2.2 主要仪器 酶标仪为赛默飞世尔科技（中国）有限公司提供，病理图像分析系统为上海普赫科技有限公司的产品，细胞免疫组织化学定量分析系统由上海申腾信息技术有限公司提供。

1.2.3 实验分组 实验前剃去小鼠背部中央区被毛，雌性BALB/c小鼠随机分为四组，分别为对照组（6只）、BLM组（6只）、PFD干预组（6只）和BLM+PFD干预组（6只）。BLM组按照文献中的方法[6-7]，建立硬皮病鼠模型，予采用皮下注射BLM的方法（1次/d，连续4周），对照组小鼠注射PBS做参照（1次/d，连续4周），PFD干预组将从第11天开始予 PFD[300mg/（kg·d）]灌胃给药（1次 /12h），直至实验结束；BLM+PFD干预组首先进行等量的BLM皮下注射，第11天开始予同等量的PFD干预治疗，直至实验结束。

1.3 指标检测

小鼠造模成功后，于第4周处死小鼠，获取小鼠背部无毛皮肤，分成2份，一份用于检测HYP含量；另一份予固定、脱水、石蜡包埋，制取4μm切片，用于HE、Masson染色和免疫组化染色。

1.3.1 皮肤羟脯氨酸（HYP）含量的测定 采用样本碱水法，按操作试剂盒步骤进行，用羟脯氨酸标准品浓度梯度溶液的OD值绘制标准曲线：根据标准曲线查得待测样本相应的羟脯氨酸含量（μg/mg），测量3次取平均值。

1.3.2 皮肤病理学观察 用HE和Masson染色法观察皮肤组织学改变。小鼠皮损处皮肤进行HE染色，肉眼和显微镜观察小鼠皮肤的变化。

1.3.3 皮肤厚度 测量皮肤厚度（表皮+真皮），皮肤HE染色切片采用病理图像分析仪自带系统软件进行测量，每只小鼠的切片随机取5处测皮肤厚度后，求得该小鼠皮肤厚度的均值，观察各组差异。

1.3.4 纤维化指数 用Masson染色计算纤维化指数。Masson染色结果：小鼠皮肤组织中胶原纤维为亮绿色，肌纤维为红色，细胞核为黑色。用细胞免疫组化定量分析系统来测定组织切片图象（×10），以亮绿色为阳性，算出每一视野中阳性表达的强度，再测定其阳性面积，然后计算平均值。每张切片随机取3个视野，每个视野大小为8500μm2。最后计算每份标本的胶原纤维指数。胶原纤维指数=阳性面积值×阳性强度。

1.3.5 小鼠皮肤CTGF蛋白和ColV分布的检测 用免疫组化染色法，主要步骤：石蜡切片使用TO进行脱蜡，使用不同浓度的乙醇水化，并对其进行抗原修复，放到3% H2O2溶液中27℃孵育10min，PBS冲洗3次（2min/次），滴加正常山羊血清工作液，27℃孵育30min；滴加兔抗鼠CTGF和ColV多克隆抗体一抗（工作浓度分别为1∶150和1∶800），用正常小鼠IgG抗体当阴性对照，放入湿盒中，于4℃冰箱内孵育过夜（约12h）。第二天，用PBS冲洗3次（2min/次），再加入驴抗兔IgG二抗（1∶500），在湿盒室温孵育20min，再用PBS冲洗3次（2min/次）加入DAB显色液显色，自来水冲洗，苏木素复染，梯度乙醇脱水，用中性树胶进行封片、室温干燥后，用显微镜观察、拍照。

1.4 统计学处理

采用SPSS20.0软件进行数据统计分析，计量资料以（x±s）表示，多组间比较采用单因素ANOVA进行统计分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 皮肤HYP含量

HYP是胶原蛋白中特有的氨基酸，测定皮肤HYP含量是评估胶原沉积的一种定量方法，可用于评定纤维化的程度。本研究结果显示，与对照组比较，PFD干预组无统计学差异；BLM组皮肤HYP含量显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；BLM+PFD干预组在使用PFD干预后，HYP含量较BLM组显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 样本碱水法检测皮肤组织HYP的含量

2.2 HE和Masson染色法观察皮肤组织学改变

一般情况：BLM组小鼠体重较对照组和PFD干预组减轻，小鼠变得迟钝，活动少，毛发色泽变暗淡无光，注射部位皮肤增厚变硬。HE和Masson染色：BLM组小鼠较对照组和PFD干预组真皮层显著增厚，胶原纤维明显增粗、数量增多，排列紧密、毛囊萎缩，纤维间隙变窄、血管管壁增厚、管腔狭窄，并伴炎性细胞浸润。而BLM+PFD干预组较BLM组上述改变减少。见图2。

图2 HE和Masson染色法观察皮肤组织学改变（×200，A、B、C、D分别为对照组、BLM组、BLM+PFD干预组和PFD干预组，1为HE染色，2为Masson染色）

2.3 各组小鼠皮肤厚度及Masson指数变化

BLM组小鼠皮肤厚度及Masson指数均明显高于BLM+PFD干预组，对照组和PFD干预组最低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠皮肤厚度及Masson染色指数比较（ ± s）

表1 各组小鼠皮肤厚度及Masson染色指数比较（ ± s）

注：与BLM组比较，#P＜0.05

组别 n Masson染色指数 皮肤厚度（μm）对照组 6 35±12# 18.5±2.2#BLM组 6 198±46 36.7±4.5 BLM+PFD组 6 112±38# 30.9±3.6#PFD组 6 39±15# 18.9±2.5#F 7.674 4.388 P 0.020 0.022

2.4 免疫组化染色法检测小鼠皮肤CTGF蛋白和ColV分布

CTGF蛋白在细胞胞浆和胞膜上呈阳性表达，对照组和PFD干预组表达阴性，BLM组真皮和基底细胞层均呈强阳性表达，ColV在真皮层、小血管及周围可聚集分布，BLM+PFD干预组较BLM组阳性表达率降低，见图3～4。结果判定：阳性为棕黄色，用细胞免疫组化定量分析系统采集免疫组化染色皮肤组织切片图象（×10），以棕黄色为阳性，计算每一视野中CTGF和ColV免疫组化阳性表达强度，再测定其阳性表达的面积，然后计算平均值，并进行相关量化计算。免疫组织化学指数=阳性面积值×阳性强度。结果显示，BLM组小鼠皮肤CTGF蛋白和ColV的免疫组化指数均明显高于BLM+PFD干预组，对照组和PFD干预组最低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

3 讨论

研究发现[8]，SD是一种以免疫异常、纤维化和血管病变为主要表现的自身免疫性疾病。我国患病率约50～300/100万[9]。皮肤和内脏的纤维化主要是由休眠的成纤维细胞激活为肌成纤维细胞，进而产生过多的Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原、胶原修饰酶和其他细胞外基质（etracellular matrixc，ECM）成分[10-11]。目前多数学者认为肺纤维化发病机制的共同特征可能是体内细胞外基质（ECM）的合成和降解的代谢失衡。病毒性肝炎后继发肝纤维化的过程就是纤维细胞激活释放过多胶原和ECM过程，同时降解活性受到抑制。

表2 各组小鼠皮肤CTGF蛋白和ColV免疫组化指数比较（x ± s）

图3 免疫组化染色法检测小鼠皮肤CTGF蛋白（A、B、C、D分别为对照组、BLM组、BLM+PFD干预组和PFD干预组，1为×100，2为×200）

图4 免疫组化染色法检测小鼠皮肤ColV分布（A、B、C、D分别为对照组、BLM组、BLM+PFD干预组和PFD干预组，1为×100，2为×200）

本研究发现，与BLM组比较，硬皮病鼠模型皮肤中的HYP含量明显高于BLM+PFD干预组和正常对照组。胶原蛋白代谢正常和异常的组织中HYP含量不同，可将HYP含量作为衡量胶原代谢的指标[12]。胶原合成过剩会使机体内部调节紊乱，引起增生病变，如肝、肺纤维化。通过测定组织中HYP含量，还能够了解肝纤维化时成纤维细胞的活性、胶原的增值及合成情况[13]，据此来监测肝纤维化患者的病理情况。本研究结果表明硬皮病鼠皮肤中有过度的胶原沉积及胶原代谢异常。

CTGF具有多种生物学活性，可促进成胶原细胞增殖、ECM和胶原沉积，与TGFβ发挥协同作用，是新发现的细胞因子[14-15]。Col V在调节免疫系统功能和诱导血管炎性改变方面发挥重要作用，是ECM起始聚集和维持细胞正常形态结构所必需的成份[16-17]。因此，我们认为CTGF和ColV可能在SD发病机制中发挥重要作用。本研究中HE和Masson染色显示，BLM组小鼠真皮层明显增厚，胶原纤维增粗、增多，血管管壁增厚、管腔狭窄，并伴炎性细胞浸润，而BLM+PFD干预组较BLM组上述改变减少。皮肤厚度及Masson染色指数结果显示，与BLM组比较，BLM+PFD干预组、对照组及PFD组小鼠的皮肤厚度及Masson染色指数是显著降低的，差异有统计学意义（P＜0.05）。说明PFD能显著改善博来霉素诱导的胶原细胞增值和炎性细胞浸润。吡非尼酮的结构是5-甲基1-苯基2（1氢），有防止甚至逆转纤维化的发生和瘢痕形成的作用，是一种新型的抗纤维化药物，在大量的研究中表现出具有抗纤维化和抗炎的作用。有实验证明吡非尼酮可以预防化学诱导的大鼠硬化性腹膜炎，对于肝脏、肺、肾脏纤维化以及皮肤瘢痕等均有明显疗效[18-20]。日本和欧盟分别在2008年和2011年批准使用吡非尼酮治疗IPF[21]。我国和美国FDA分别于2013年和2014年批准PFD用于治疗IPF[22]。PFD抗纤维化作用的机制尚处于研究之中，但大量的研究已经证明PFD是一种有效的细胞因子抑制剂，能够通过参与调节某些因子，抑制成纤维细胞的生物学活性，导致细胞增殖受抑，基质胶原合成减少[23]。目前发现PFD作用的靶因子有：TGF-β、CTGF、TNF-α、PDGF和其他因子。

有研究显示，在SD患者皮肤组织中，CTGF在表皮基底层细胞和成纤维细胞中均有强阳性表达；而在正常皮肤组织的表皮和真皮表达信号微弱或阴性[24]。本研究中免疫组化染色显示，BLM组硬皮病鼠真皮和基底细胞层CTGF蛋白均呈强阳性表达，与文献报道的一致；ColV在真皮层、小血管及周围可聚集分布，BLM+PFD干预组较BLM组阳性表达率降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。免疫组化指数结果进一步显示，与BLM组比较，BLM+PFD干预组、对照组及PFD组小鼠的皮肤CTGF蛋白与ColV免疫组化指数是显著降低的，差异有统计学意义（P＜0.05）。CTGF与ColV在BLM组小鼠皮肤中表达均升高，说明两者共同参与了SD的发生、发展，而且CTGF与ColV之间可能存在某种因果关系。予吡非尼酮干预后两者的含量均降低，说明PFD可能通过作用于CTGF导致ColV的增值受抑制。

综上所述，皮肤中CTGF和ColV表达增多是硬皮病发生发展的重要原因，采用PFD灌胃治疗后，可降低CTGF和ColV的含量，相关因子可能成为治疗硬皮病的潜在靶点。