合果芋-内生菌共生体系修复低浓度铀废水的实验研究

何 柳,邓钦文*,周天豪,王 帆,袁巧林

(1.南华大学 资源环境与安全工程学院,湖南 衡阳 421001;2.南华大学 铀矿冶生物技术国防重点学科实验室,湖南 衡阳 421001;3.南华大学 衡阳市土壤污染控制与修复重点实验室,湖南 衡阳 421001)

0 引 言

铀矿冶对我国的原子能事业的发展做出了巨大贡献，但其产生的尾矿和含铀废水，同样对周边土壤和水环境造成不可忽视的影响。L.Xiang调研和评估了华东地区某铀矿厂附近的农田，发现在水稻中存在多种重金属，且铀含量较高，单因素指标评估为中度污染，对人体有致癌等健康危害[1]。

高富集植物是研究的热点。高富集植物[2-3]有较高的平均生物浓度因子和转移系数，可用于植物稳定化或植物富集提取。但铀污染环境对植物存在毒害作用，严重破坏根的结构，对植物细胞的新陈代谢、基因突变、基因转录和表达都有影响[4]。铀的毒害作用会降低植物修复的效果，使植物修复法存在一定局限性。

目前，已有较多研究表明，植物-微生物联合修复，效果要优于单一的植物修复和微生物修复。丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)和根瘤菌等微生物通过改善土壤环境、增强植物抗污染胁迫能力、促进植物生长等方式，显著提高植物修复铀污染的效果[5-7]。M.Kalin提出藻类(algae)和微生物构建的修复系统三步修复法[8]。C.Zou等人研究发现Aspergillusniger(黑曲霉)能改变铀的化学形态来降低毒性并限制其在植物体内的迁移，从而提高植物在铀污染环境中的生长[9]。在含铀废水治理研究中，J.D.He构建的合果芋-黑曲霉共生净化体系亦能有效的去除水体中的铀，能将0.5、1.0、3 mg/L的铀降到0.05 mg/L以下[10]。C.Zou等人研究Aspergillusniger(黑曲霉)-合果芋共生体系的净化机理，发现Aspergillusniger(黑曲霉)能改变铀的化学形态来降低毒性并限制其在合果芋体内的迁移，并且提高铀在合果芋根部细胞壁的固定和亚细胞区域化，降低铀的毒害作用，提高合果芋对铀的富集作用[9]。植物-微生物联合修复，其抗铀胁迫性和极端环境适应性更强，适用性更广，且成本较低，是一种非常安全有效的铀污染修复方法，具有广阔的研究和实用前景。

合果芋是一种常见的观赏性植物，可以进行土培和水培，环境适应性很强，可用于多种污染物吸附，是一种理想富集植物。Q.W.Deng等人研究了Pseudomonassp.XNN8(铜绿假单胞菌XNN8)与合果芋构建的共生净化系统对含铀废水治理的研究，发现该共生体系对低浓度铀废水有较理想的治理效果[11]。本次研究以以上为基础，使用合果芋作为实验植物，在Pseudomonassp.XNN8的基础上，新增一种实验室前期分离出的放线菌XNG3作为实验内生菌，构建不同的共生体系，探讨不同内生菌定殖合果芋的净化效果，以及单一菌株、两种菌株共同定殖合果芋的联合共生体系的修复效果，选出最优共生体系，为后期研究和铀污染修复实际应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

植物选择合果芋(SyngoniumpodophyllumSchott)，购买于衡阳市花鸟市场。

微生物选用已分离和保存的优势菌株：细菌Pseudomonassp.XNN8和放线菌XNG3[11]。实验室在某铀尾矿坝附近水体的香蒲草(TyphaorientalisPresl)中，提取了数十种微生物，其中具有产铁载体、ACC脱氨酶、IAA吲哚乙酸的且耐铀性强的优势菌种是XNN8与XNG3，故选用此两种作为构建合果芋-内生菌共生体系的菌株。

1.2 微生物提纯与扩培

使用固体培养基平板划线法对实验室保存菌种进行活化提纯，使用液体培养基进行菌种扩培。其中细菌XNN8使用牛肉高蛋白胨培养基进行提纯扩培，放线菌使用改良高氏一号培养基进行提纯扩培。

微生物扩培实验如图1所示。

1.3 植物-内生菌联合体系的构建

扩培溶液经离心、提取、稀释后，得实验用菌液。使用注射、浸根两种方式将细菌定殖于合果芋根部。由于放线菌菌体大，无法使用注射定殖，使用灌根和浸根两种方式进行定殖。实验温度为25 ℃。本次实验在水培条件下，灌根需构建特殊的土壤环境：合果芋上层根部使用土壤包裹固定，置于水面以上，使合果芋处于上层空气、中层土壤、下层水溶液的环境中，结构如图2所示。

首先构建四个实验组，A与B，C与D分别考察细菌XNN8和放线菌XNG3的最适定殖方式；使用最佳方式将两菌种共同定殖于合果芋，构建合果芋-双菌种共生体系E实验组；使用未定殖的合果芋做空白对照组。实验设计如表1所示。

表1 实验设计

1.4 水培实验与铀浓度测定

配制铀浓度为1 mg/L，pH值为7.0的中性低浓度硝酸体系铀酰溶液，对A、B、C、D共生体系实验组进行水培实验，考察不同定殖方式构建的体系对修复铀废水的影响，各组设立三个平行样，观测其溶液铀浓度变化，在5 d、10 d、15 d、20 d，25 d取样，铀浓度的测定方法采用ICP-MS测定。

配置铀浓度为1 mg/L、0.5 mg/L、2 mg/L的pH值为7.0的中性低浓度硝酸体系铀酰溶液，对新构建的E实验组、F空白对照组进行水培实验，研究合果芋-双内生菌共生体系修复低浓度铀废水的效果和可行性。

水培实验如图3所示。

1.5 官能团分析

使用红外光谱(IR)分析植物富集铀过程中参与反应的官能团，取植物的根部，进行干燥破碎等预处理后，送至上海荟铭检测设备有限公司测样分析。

2 结果与讨论

2.1 细菌XNN8定殖体系实验结果

在细菌XNN8定殖体系中，浸根组在实验前期效果要优于注射组，后期出现反转，第25天，XNN8注射定殖体系的铀溶液浓度从初始1 mg/L降至12.115 μg/L，低于浸根定殖组15.367 μg/L。细菌XNN8定殖实验数据如图4所示。

细菌XNN8更适用注射法定殖。分析其原因，实验前期，浸根法让细菌更多的定殖到根部各部位，而注射法仅在根部注射部位定殖了细菌，使得水培实验前期浸根法效果优于注射法，而随着时间推移，注射定殖的细菌逐渐定殖到植物各部位，联合体系修复效果迅速提升，最终超越浸根法，基于铀污染修复的长效性，注射法定殖细菌XNN8更适用。

2.2 放线菌XNG3定殖体系

在放线菌XNG3定殖体系中，浸根组在实验前期效果要优于灌根组，后期出现反转，XNG3灌根定殖体系的铀溶液浓度从初始1 mg/L降至13.940 μg/L，低于浸根定殖组17.422 μg/L。放线菌XNG3定殖实验数据如图5所示。

放线菌XNG3更适用灌根法定殖。分析其机理与细菌XNN8的定殖类似，灌根法相比浸根法需要更多时间进行放线菌定殖，但最终效果优于浸根法，故灌根法更适用放线菌XNG3。放线菌XNG3的测序鉴定尚待研究。

2.3 双菌种联合定殖体系实验结果

使用XNN8注射与XNG3灌根联合定殖合果芋，构建共生体系，与未定殖的空白对照组进行水培实验对比。初始铀浓度1 mg/L的水培实验结果如图6所示，共生体系的铀污染修复效果始终优于未定殖的合果芋。

初始铀浓度0.5 mg/L和2 mg/L的水培实验结果如图7和图8所示，铀浓度变化趋势和两体系优势差异与1 mg/L的水培实验结果相近。

初始浓度1 mg/L、0.5 mg/L、2 mg/L铀溶液水培实验第25天铀浓度和铀富集率如表2所示。不同初始浓度水培实验中，双菌种定殖共生体系修复铀废水的效果都明显优于未定殖内生菌的空白对照组，最高富集率98.34%，且共生体系中铀浓度均降致0.05 mg/L以下，可用于低浓度铀污染废水的治理。未定殖内生菌的合果芋，在初始浓度2 mg/L铀溶液中铀浓度降至61.851 μg/L，未达到排放标准，修复效果不佳。

表2 第25天铀浓度和铀富集率

对比单菌种定殖实验结果，1 mg/L条件下，细菌XNN8定殖体系和放线菌XNG3定殖体系修复铀废水浓度分别降至12.115 μg/L、13.940 μg/L，效果略优于双菌种定殖体系的17.903 μg/L，但双菌种定殖合果芋共生体系也达到了修复效果。两菌种的协同机理以及可能的拮抗作用将是今后进一步实验的研究重点。

2.4 IR分析结果

取定殖双菌种的合果芋和未定殖的合果芋根部样品，经预处理后进行IR红外光谱表征。植物组成有纤维素、半纤维素、木质素等，含有多糖、酚类、醇类、酯类、羟基、羧基、氨基等多种成分[12]，以此分析红外光谱中的信息，红外光谱如图9所示。

定殖了内生菌的合果芋，原3 381.62吸收峰迁移到3 419.23，这是糖类C—OH的—OH伸缩，—OH对U有络合作用[13-18]，说明内生菌的定殖可能使得联合体系比未定殖的合果芋产生更多的糖类和 —OH，或者促进植物中—OH对U的结合作用。

3 结 论

实验研究了合果芋与细菌XNN8、放线菌XNG3构建的共生体系对低浓度铀污染废水修复效果，探究了微生物的最适定殖方式，以及不同初始铀浓度、是否定殖内生菌对修复效果的影响，使用红外光谱(IR)分析植物富集铀过程中参与反应的官能团，为低浓度铀污染废水提供一种可行的修复方法。

综合以上实验结果和分析，本次实验研究总结如下：

1)细菌XNN8更适用注射法定殖合果芋。

2)放线菌XNG3更适用灌根法定殖合果芋。

3)定殖了内生菌的合果芋修复铀污染废水效果优于未定殖的合果芋。

4)铀初始浓度0.5 mg/L条件下，合果芋-内生菌共生体系最高铀富集率98.34%，铀浓度降至16.615 μg/L；1 mg/L、2 mg/L条件下废水铀浓度分别降至17.903 μg/L、26.067 μg/L，均达到排放标准，可用于修复低浓度铀污染废水。

5)内生菌可能提高了合果芋根部的—OH含量或强化了官能团的结合作用。