中华绒螯蟹抱卵前后脂肪酸和氨基酸组成的比较

姬慧 冯广朋 宋超 王海华

摘要：为研究中华绒螯蟹抱卵前后体成分变动规律，测定分析了雌蟹抱卵前后不同组织（性腺、肝胰腺、肌肉）中的脂肪酸和氨基酸的变动。结果表明，抱卵前肝胰腺指數（7.31±0.73）显著高于抱卵后（5.59±0.82）（P<0.05）。在肌肉和肝胰腺中，抱卵前饱和脂肪酸（SFA）和单不饱和脂肪酸（MUFA）百分量均显著高于抱卵后（P<0.05），其中脂肪酸C16∶00和C18∶1n9百分量最高;抱卵前多不饱和脂肪酸（MUFA）中C18∶2n6和C18∶3n3百分量显著高于抱卵后（P<0.05），但EPA（C20∶5n3）和DHA（C22∶6n3）百分量低于抱卵后。与抱卵前相比，抱卵后雌蟹肝胰腺和肌肉中氨基酸含量均显著升高（P<0.05），其中谷氨酸含量最高、半胱氨酸含量最低。研究结果揭示，脂肪是中华绒螯蟹雌蟹繁殖前期的主要能源代谢底物，氨基酸在繁殖期逐渐积累。

关键词：中华绒螯蟹;抱卵蟹;生化成分;氨基酸;脂肪酸

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）是洄游性的经济物种，具有重要的养殖和食用价值[1]。长江水系野生种群味道鲜美、营养丰富、风味独特，其可食组织的不饱和脂肪酸和蛋白质含量高[2]，相比其它水系野生河蟹，其养殖规模最大[3]。近年来，由于过度捕捞、湿地围垦、环境污染等原因，造成天然河蟹资源迅速衰退[4]。繁殖期是动物延续种群的重要生活史阶段，为保护和恢复长江口野生河蟹资源，许多研究者对繁殖阶段的中华绒螯蟹开展了多方面研究工作，如亲蟹增殖放流[5]、产卵场生境评估[6]、食性[7]、胚胎发育[8]等方面。

动物的能量一般分配为三部分：维持个体基本生存、生长发育和繁殖[9， 10]，对于性成熟个体而言，投入到生长发育中能量较少，除部分能量用于维持基本生存外，大部分能量均投入到繁殖中[11]。蛋白质和脂质作为中华绒螯蟹机体提供能量的主要物质载体，对其繁殖力、受精率、孵化率等繁殖活动具有重要作用[12， 13]。肌肉和肝胰腺是甲壳动物的重要供能组织，其中肝胰腺在甲壳动物中被认为是营养物质消化吸收和储存的器官[14]，其能量物质载体的变动一定程度上能够反映机体对能量的利用模式。多数研究表明，氨基酸和脂肪酸在水生动物繁殖期间被利用的先后顺序因物种而存在差异，如Gendron等[15]报道了繁殖期美洲龙虾（Homarus americanus）的主要代谢能源为蛋白质，刘凯等[16]报道了繁殖期太湖秀丽白虾的主要代谢能源为脂肪。目前，对长江口中华绒螯蟹繁殖期脂肪酸和氨基酸的研究相对较少。因此，本研究通过比较长江口中华绒螯蟹抱卵前后不同组织（性腺、肝胰腺、肌肉）中脂肪酸和氨基酸的变化规律，以期为阐述中华绒螯蟹的繁殖生理学，种群生态学提供一些基础数据，为长江口中华绒螯蟹的种质资源保护提供参考依据。

1  材料与方法

1.1  实验材料

实验所用的中华绒螯蟹雌蟹均采自长江口（121°57′33.76″E， 31°23′33.41″ N），抱卵前和抱卵后的雌蟹样品采集后，分别作为2个实验组，每个实验组分别挑选出体重相似、个体健壮、附肢完整的个体各15只，首先将蟹檫干体表水分，用电子天平进行称重，用游标卡尺对蟹进行壳长和壳宽的测量，然后将每只蟹在冰盘上依次进行活体解剖，分别取出肝胰腺、肌肉和性腺，称取组织重量，用于计算肝胰腺指数（hepatosomatic index， HSI）和性腺指数（gondosomatic index， GSI）。称重后立即保存于-80 ℃冰箱中用于生化测定。测定时将样品在105 ℃下烘干，磨碎，混合均匀，然后将样品分成两份，一份做常规生化成分分析，另一份做氨基酸和脂肪酸的测定。

抱卵前雌蟹平均体重为60.91±1.95 g，平均壳长为47.45±5.08 mm，平均壳宽为52.45±5.45 mm;抱卵后雌蟹平均体重为86.41±4.29 g，平均壳长为51.20±2.25 mm，平均壳宽为57.40±2.36 mm，卵块平均重量为22.50±4.78 g。

肝胰腺指数（Hepatosomatic Index，HSI，%）=肝胰腺重/体重×100

性腺指数（Gonad index，GSI，%）=性腺中/体重×100

1.2  脂肪酸测定

脂肪酸分析依据WU等[17]的方法，采用14%的三氟化硼-甲醇（V∶V）对总脂进行甲酯化处理，旋转蒸发到所需浓度进行脂肪酸分析。使用5975C-7890A气相色谱-质谱联用仪（GC-MS），FFAP弹性石英毛细管柱（30 m×0.53 mm，1μm），进样口和氢火焰检测器的温度分别为270℃和280℃，起始柱温为50℃，程序逐渐升温到250℃，直到所有脂肪酸全部出峰。脂肪酸含量的计算采用面积百分比法，每个实验组样品均重复测定6次。

1.3  氨基酸测定

总氨基酸参考CHEN等[18]的方法进行测定。精确称取烘干后的样品约0.05 g，置于厌氧水解管中，加入6 mol/L盐酸5 mL混匀，放入液氮中冷冻，待溶液凝固后取出，在真空泵抽气管上抽真空封管，然后放入110℃的恒温干燥箱内水解24 h，水解产物冷却后用蒸馏水稀释并定容至10 mL，离心后用0.45 μm水系滤膜过滤除杂，取1 mL过滤后的上清液到试管中，在真空浓缩仪内真空干燥，残留物用1 mL去离子水溶解，在干燥，反复进行2次，最后加入1 mL pH2.2样品缓冲溶解，0.22 μm水系膜过滤，使用德国赛卡姆公司S-433D型氨基酸自动分析仪进行测定;参考SPINDLER等[19]方法，采用过蛋氧化水解法测定半胱氨酸含量。

1.4  数据处理

采用MS Excel 2013软件对实验数据进行统计分析，所有数据均以平均值±标准误差表示。采用SPSS 18.0软件的单因素方差分析（one-way ANOVA）和独立样本T检验对实验数据进行显著性分析，取P<0.05为差异显著。

2  结果与分析

2.1  抱卵前和抱卵后脂肪酸含量的比较

抱卵前后肝胰腺和肌肉中脂肪酸的变动见表1。在肝胰腺组织中，抱卵前饱和脂肪酸（SFA）中C14∶0、C15∶0、C16∶0、C17∶0和C18∶0的百分量显著高于抱卵后（P<0.05）;对于单不饱和脂肪酸（MUFA）而言，抱卵前肝胰腺组织中C15∶1n5、C16∶1n7、C17∶1n7和C20∶1n9百分量均显著高于抱卵后（P<0.05）;与抱卵前相比，抱卵后肝胰腺组织多不饱和脂肪酸（PUFA）中C18∶2n6和C18∶3n3分别显著下降2.50%和5.86%（P<0.05），但C20∶4n6（ARA）、C20∶5n3（EPA）和C22∶6n3（DHA）百分量分别升高0.97%、1.53%和15.16%，其中C20∶4n6（ARA）和C20∶5n3（EPA）百分量在抱卵前后肝胰腺中无显著差异性（P>0.05）。

在肌肉组织中，抱卵前饱和脂肪酸（SFA）中除C14∶0外，C15∶0、C16∶0、C17∶0和C18∶0百分量均显著高于抱卵后（P<0.05）;对于单不饱和脂肪酸（MUFA）而言，抱卵后肌肉组织中除C16∶1n7百分量（5.14±0.16）显著高于抱卵前（0.34±0.05）（P<0.05）外，其余单不饱和脂肪酸（MUFA），如C15∶1n5、C17∶1n7和C20∶1n9百分量均在抱卵后显著下降（P<0.05）;对于多不饱和脂肪酸而言，抱卵前肌肉组织中C18∶2n6、C18∶3n3和C20∶4n6百分量显著大于抱卵后（P<0.05），但抱卵后肌肉组织中C20∶5n3（EPA） 和C22∶6n3（DHA）百分量显著高于抱卵前（P<0.05）。

在肝胰腺、性腺和肌肉组织中，抱卵前脂肪酸中除C16∶0、C15∶1n5和C22∶6n3外，3个组织中其余脂肪酸百分量均存在显著差异（P<0.05）;除C20∶4n6和C20∶5n3外，抱卵前肝胰腺中其余脂肪酸百分量均显著高于肌肉和性腺组织（P<0.05）。

2.2  抱卵前和抱卵后氨基酸含量的比较

抱卵前后肝胰腺和肌肉中共检测出17种水解氨基酸，其中人体必需的氨基酸有9種，非必需氨基酸（NEAA）有8种（表2）。在肝胰腺组织中，抱卵前和抱卵后的9种必需氨基酸（EAA）的含量范围分别为1.03～6.57 mg·g-1和1.83～17.41 mg·g-1;抱卵后的9种必需氨基酸（EAA）含量均显著大于抱卵前（P<0.05）;抱卵前肝胰腺中必需氨基酸（EAA）含量最高和最低的均为亮氨酸和半胱氨酸;抱卵后肝胰腺中非必需氨基酸（NEAA）含量均显著高于抱卵前（P<0.05），抱卵前和抱卵后肝胰腺中8种非必需氨基酸（NEAA）含量范围分别为2.78～7.63 mg·g-1和8.30～23.09 mg·g-1;抱卵前后肝胰腺中非必需氨基酸（NEAA）含量最高的均为谷氨酸 （15.46 mg·g -1），但抱卵前和抱卵后非必须氨基酸（NEAA）含量最低的分别为脯氨酸（2.78 mg·g-1）和丙氨酸（8.30 mg·g-1）。

在肌肉组织中，抱卵后的必需氨基酸（EAA）和非必需氨基酸（NEAA）含量均显著高于抱卵前（P<0.05）;抱卵前和抱卵后肌肉中必需氨基酸含量范围分别为2.80～20.45 mg·g-1和9.58～29.25 mg·g-1;抱卵前和抱卵后肌肉中必需氨基酸（EAA）含量最高和最低的分别均为赖氨酸和半胱氨酸;抱卵前和抱卵后肌肉中非必需氨基酸（NEAA）含量最高的为谷氨酸，但最低的分别为脯氨酸（16.69 mg·g-1）和丝氨酸（28.00 mg·g-1）。

在肝胰腺、肌肉和性腺组织中，抱卵前的总必需氨基酸和总非必需氨基酸含量的高低依次为肌肉>性腺>肝胰腺;抱卵前必需氨基酸含量与总氨基酸含量的比值（WEAA/WTAA）在性腺、肝胰腺和肌肉中依次为42.18、41.78和34.43，必需氨基酸含量与非必需氨基酸含量的比值（WEAA/WNEAA）在性腺、肝胰腺和肌肉中依次为73.69、71.82和52.49.

3  讨论

3.1  抱卵前和抱卵后脂肪酸含量的变动

有研究表明，甲壳动物体内用于氧化供能的脂肪酸为饱和脂肪酸（SFA）和单不饱和脂肪酸（MUFA），多不饱和脂肪酸（PUFA）一般作为功能性物质储存在体内[20-22]。本研究中，中华绒螯蟹抱卵后肝胰腺和肌肉中的饱和脂肪酸 （SFA）和单不饱和脂肪酸（MUFA）均显著下降，多不饱和脂肪酸（PUFA）中除C20∶5n3（EPA）和C22∶6n3（DHA）外，其余脂肪酸在抱卵后出现下降，推测可能是因为长江口中华绒螯蟹抱卵后在12月到第二年2月期间摄食强度最低[7]，导致中华绒螯蟹繁殖前期利用肝胰腺和肌肉中的脂肪氧化提供能量。此外，本研究中抱卵前后肝胰腺和肌肉中C16∶0和C18∶1n9百分量较高，这在其它甲壳动物中也存在类似情况[23， 24]，推测这两种脂肪酸是构成甲壳动物体成分的保守脂肪酸。甲壳动物体内的长链多不饱和脂肪酸（PUFA）对其卵的受精率和孵化率具有重要作用[25-27]，其中C20∶5n3（EPA）与亲本雌蟹的产卵量呈正相关[28-30]，C22∶6n3（DHA）与亲蟹的受精率和孵化率呈正相关[31]。本研究中在肝胰腺和肌肉组织中，抱卵后多不饱和脂肪酸（PUFA）中C20∶5n3（EPA）和C22∶6n3（DHA）百分量高于抱卵前，其余多不饱和脂肪酸（PUFA）均在抱卵后中降低，推测C22∶6n3（EPA）和C22∶6n3（DHA）不是中华绒螯蟹繁殖前期优先利用的供能脂肪酸，含量的升高可能为抱卵后胚胎的孵化做准备，这与封强梅等[24]研究降海洄游的中华绒螯蟹结果一致。

3.2  抱卵前和抱卵后氨基酸含量的变动

氨基酸是蛋白质的基本结构单位，蛋白质不仅对动物维持正常结构和功能具有重要作用，而且也作为重要的能量物质载体[32]。有研究表明，一般情况下，动物体内蛋白质含量相对稳定，当机体面临饥饿情况时，主要利用蛋白质作为代谢能源[33]。本研究中，抱卵后肝胰腺和肌肉组织中的氨基酸含量显著高于抱卵前，主要原因可能是当长江口饵料充足时，抱卵前组织积累的蛋白质足够满足繁殖前期的生理活动，因此抱卵后的氨基酸含量能够逐渐积累;当中华绒螯蟹抱卵蟹在水中完成胚胎发育后，更倾向于利用蛋白质作为能源代谢物质[34]，因此抱卵后氨基酸含量的升高可能为抱卵蟹胚胎发育做准备。这与瓦氏黄颡鱼[35]繁殖前后、太湖花?[36]繁殖前后研究结果一致。此外，本研究还发现，抱卵前后雌蟹在不同组织中必需氨基酸含量最高的是亮氨酸，非必需氨基酸含量最高的是谷氨酸，推测可能因为亮氨酸的分解产物为乙酰乙酸和乙酰CoA，由于两者均参与脂类和糖类的代谢过程，因此高含量的亮氨酸能够快速调配糖类、脂肪和蛋白质三大能源物质的代谢;研究表明甲壳动物分解的含氮终产物主要以氨氮形式排放，其中谷氨酸能够与水产动物蛋白代谢物NH3结合，经谷氨酰胺酶分解成游离的NH3排出体外[37]，这可能是抱卵前后体组织谷氨酸含量高的原因之一。根据FAO/WHO的理想模型，质量较好的蛋白质其组成氨基酸WEAA/WTAA为40%左右，WEAA/WNEAA在60%以上[38]。本研究中抱卵前雌蟹和抱卵蟹必需氨基酸占总氨基酸的比值（WEAA/WTAA）在性腺、肝胰腺和肌肉中分别为49.04 mg·g-1、41.78 mg·g-1、33.16 mg·g-1、38.84 mg·g-1及39.41 mg·g-1，必须氨基酸与非必需氨基酸（WEAA/WNEAA）的比值分别为96.21 mg·g-1、96.11 mg·g-1、49.61 mg·g-1、63.50 mg·g-1及65.04 mg·g-1，只有抱卵前雌蟹性腺和肝胰腺中蛋白质含量符合FAO/WHO的理想模型，表明抱卵前的蛋白质质量高于抱卵后。

4  结语

繁殖期不仅是中华绒螯蟹生活史中重要的阶段，而且也是高耗能阶段，脂肪和蛋白质是主要的能源物质载体，目前对中华绒螯蟹抱卵前后对能源物质利用研究相对较少。本研究表明，长江口中华绒螯蟹抱卵前后体组织脂肪酸和氨基酸存在差异;脂肪是中华绒螯蟹繁殖前期的主要能源代谢底物，氨基酸在抱卵后积累。建议对进行生殖放流前的中華绒螯蟹雌蟹加强脂类的营养强化。

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