圆齿野鸦椿果皮总多酚的提取及其抗炎作用

王玉启, 冯 翯, 姚秋娟, 范琳俐, 金 航, 黄 维

(1.福建农林大学生命科学学院；2.自然生物资源保育利用福建省高校工程研究中心;3.福建农林大学林学院，福建 福州 350002)

圆齿野鸦椿(EuscaphiskonishiiHayata，又名福建野鸦椿)为省沽油科野鸦椿属常绿小乔木[1]，是我国特有珍稀药用观赏树种，也是福建省民间传统药材，其根或皮、花、叶、果都可作药用，主治胃痛、寒疝、脱肛、月经不调等[2-3].圆齿野鸦椿果皮中主要含有多酚[4]、三萜[5]、黄酮类[6]等物质，具有抗炎镇痛、保肝抗癌等作用[7-9].其中，多酚类化合物是一类广泛分布的植物次生代谢产物，具有抗炎、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、提高免疫力[10-12]等多种生物活性，开发前景良好.然而，目前有关圆齿野鸦椿中多酚的研究较少，其提取工艺尚未见报道.本文以超声波法提取圆齿野鸦椿果皮总多酚(total polyphenols fromE.konishiipericarp, TPEP)，采用Box-behnken试验对TPEP提取工艺进行优化，并考察了TPEP的体外抗炎活性，以期为圆齿野鸦椿的开发和利用提供参考.

1 材料

1.1 药品与试剂

圆齿野鸦椿于2018年10月采自福建省邵武市天成岩，经福建农林大学邹双全研究员鉴定为省沽油科野鸦椿属圆齿野鸦椿.将果实晒干后分离果皮和种子，果皮粉碎成粉并过50目筛备用.

胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、DMEM高糖培养基、青链双抗和PBS溶液购自Hyclone公司，四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)、内毒素脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、没食子酸购于北京索莱宝生物科技有限公司，地塞米松购自上海生工生物工程股份有限公司，福林酚试剂购于麦克林试剂有限公司，前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)酶联反应试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，NO检测试剂盒购自江苏碧云天生物技术有限公司，其他试剂均为分析纯.

1.2 仪器

二氧化碳培养箱(美国Thermo Forma)，UV-2700紫外可见分光光度计(日本岛津公司)，BS-210S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，RE52CS-2旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，KQ-500DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，Millipore Synergy-UV超纯水机(美国密理博公司)，101A-0数显式电热恒温干燥箱(上海阳兴试验仪器有限公司)，TGL-16C离心机(上海安亭科学仪器厂).

1.3 细胞培养

小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞(购于中国科学院上海细胞库)用DMEM高糖培养基(含10% FBS、1%双青链双抗)置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养.

2 方法

2.1 TPEP的提取

取圆齿野鸦椿果皮干粉3.0 g放于250 mL圆底烧瓶中，根据试验设计方案，加入一定浓度的乙醇溶液，按照相应的液料比，放入水浴锅中，控制提取的温度、超声功率以及时间，获得提取溶液.

2.2 Box-behnken试验

根据前期单因素试验，选择乙醇浓度(体积分数)40%、50%、60%，液料比20∶1、30∶1、40∶1，提取温度40、50、60 ℃，超声功率200、300、400 W，及提取时间60、90、120 min，进行Box-behnken试验，用Design-Expert V8.0.6软件对结果进行多元线性回归和二项式拟合.

2.3 多酚含量测定

采用Folin-Ciocateau法[13]测定总多酚的含量.取100 mg经105 ℃干燥处理后的没食子酸，用无水乙醇温热溶解到100 mL的烧杯里，待溶液温度至常温后用无水乙醇定容至100 mL.分别量取没食子酸溶液1、2、3、4和5 mL置于100 mL容量瓶中，用无水乙醇配制10、20、30、40和50 mg·L-1没食子酸工作液.分别取1 mL工作液至10 mL刻度试管中，加入5 mL福林酚试剂反应10 min，再加入4 mL 2% Na2CO3溶液摇匀，在室温环境下静置1 h，然后在波长760 nm处测定溶液的光密度(D760 nm).获得对照品浓度与光密度的标准曲线方程:y=0.012 6x+0.019 2(R2=0.999 3)，x为没食子酸对照品的浓度(mg·mL-1)，y为D760 nm.

2.4 TPEP的制备

取圆齿野鸦椿果皮10 kg，用60%乙醇提取，将乙醇提取物浓缩后上样到大孔吸附树脂ASD7.先用蒸馏水去除多余的蛋白、色素等杂质，再以30%～70%的乙醇洗脱样品，薄层色谱(thin layer chromatography, TLC)检测以1%三氯化铁乙醇溶液/1%铁氰化钾水溶液(1∶1)呈蓝紫色为标准，收集含多酚的组分，浓缩后得到TPEP.

2.5 TPEP抗炎活性测定

取处于对数生长期的细胞密度为 2×105个·mL-1的小鼠巨噬细胞RAW264.7接种于96孔板内，每孔加入180 μL，将其放入细胞培养箱中过夜.设置空白组、模型组(LPS浓度为1 μg·mL-1)、试验组(加入LPS和不同剂量的TPEP)和阳性对照组(200 μg·mL-1地塞米松)，每种处理在96孔板内设5个复孔.试验组按25、50、100、200 μg·mL-1的TPEP给药，给药2 h后模型组和试验组每孔加20 μL相应浓度的LPS，对照组每孔加20 μL的含血清培养基，22 h后分别用PGE2、IL-6、TNF-α ELISA试剂盒和NO试剂盒检测上清液中细胞所分泌的炎性因子的浓度.

2.6 数据处理

运用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，每组数据重复3次，试验结果以平均值±标准差表示.采用Duncan′s多重比较法检测各组数据间的差异显著性，当P<0.05时认为差异具有统计学意义.

3 结果与分析

3.1 Box-behnken试验

3.1.1 回归模型拟合 在单因素考察的基础上，结合中心组合设计原理，选取乙醇浓度(A)、液料比(B)、提取温度(C)、超声功率(D)和提取时间(E)5个因素作为自变量，以TPEP提取量(Y)作为因变量，设计5个因素3个水平的响应面试验(表1)，设计方案及结果见表2.

表1 Box-behnken试验设计因素和水平

表2 响应面分析方案及结果

运用Design-Expert V8.0.6软件采取响应面法分析表2的数据，将TPEP的提取率作为响应值，对各因素进行线性模型拟合，得到多元二次回归模型方程:Y=7.71-0.070×A-0.087×B+6.250E-003×C+0.056×D-1.000E-002×E+0.080×AB+0.022×AC-0.025×AD+0.027×AE+0.018×BC-7.500E-003×BD-0.017×BE+0.000×CD-0.010×CE-0.020×DE+0.35×A2+0.026×B2+4.792E-003×C2-0.024×D2+6.458E-003×E2(R2=0.942 6).通过二次模型及其回归系数的方差分析检验该模型的可靠性，所得结果见表3.

该模型P<0.000 1，失拟项P=0.065 3>0.05，表明模型与实际拟合较好，可以用来预测TPEP提取率并分析优化结果.由F值可得出，各因素对试验结果的影响大小表现为液料比>乙醇浓度>超声功率>提取时间>提取温度.

表3 回归模型方差分析1)

1)*为差异显著(P<0.05)；**为差异极显著(P<0.01).

3.1.2 响应面工艺优化分析 从5个因素交互作用响应面(图1～2)的陡峭情况可以看出，AB、AC、AD和AE的相互作用对TPEP提取率均具有较大影响.通过Design-Expert V8.0.6分析得出TPEP提取最佳工艺：乙醇浓度为43.73%，液料比为31.07∶1，提取温度为52.72 ℃，超声功率为298.46 W，提取时间为72.23 min.该条件下TPEP提取率达到8.32%.根据试验条件调整，最终将乙醇浓度45%、提取温度50 ℃、液料比31∶1、提取时间70 min和超声功率300 W确定为最佳提取工艺.在进行3次验证试验后，得到TPEP提取率平均值为(8.28±0.14)%，与理论值较为接近，且重复性好,表明应用响应面法得出的回归模型较可靠.

3.2 TPEP的抗炎活性

以LPS作用于巨噬细胞RAW264.7构建体外炎症的细胞模型.如表4所示，模型组在用1 μg·mL-1LPS作用细胞22 h后，RAW264.7细胞上清液中的NO、PGE2、IL-6和TNF-α分泌量较空白组显著增加(P<0.01).将TPEP以DMSO溶解后用不含血清的培养基稀释成不同的浓度，分别对LPS诱导的RAW264.7细胞给药，结果表明25、50、100和200 μg·mL-1TPEP呈现剂量依赖性地抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7分泌炎性因子NO、PGE2、IL-6和TNF-α.同时，采用MTT法分析TPEP对细胞的毒性作用，发现RAW264.7细胞的存活率均超过了90%，说明TPEP的抗炎活性与其细胞毒性无关.

4 讨论

响应面法主要通过建立连续变量的多维曲面模型，拟合各因素与响应值间的函数关系，评价各种影响生物过程的因子之间的交互作用，以确定各个因子最佳水平范围，是一种较为高效的统计学方法[14].本试验通过应用响应面法改进TPEP的提取工艺，利用Box-behnken试验进行回归模型拟合以及优化分析，确定了最佳的提取工艺为提取时间70 min、液料比31∶1、提取温度50 ℃、乙醇浓度45%和超声功率300 W，在此提取条件下TPEP提取率为(8.28±0.14)%.

表4 TPEP对LPS诱导RAW264.7细胞分泌NO、TNF-α、PGE2和IL-6的影响1)

1)与空白组比较，##表示P<0.01；与模型组比较，*表示差异显著(P<0.05)， **表示差异极显著(P<0.01).

炎症是机体对自身受到的各种损伤应激所产生的一种防御现象，然而有研究发现过度的炎症反应常与心血管疾病、肿瘤等多种疾病的发生、发展密切关联[15-16]，因此，抗炎类药物开发是目前药物研究的热点之一.LPS具有极强的致炎性，能诱导巨噬细胞启动炎症反应而引起炎症级联反应，因而常被用作炎症模型的诱导剂[17-18].本课题组在前期研究中发现，圆齿野鸦椿果皮醇提物在抗炎方面有着不俗的表现[8]；本研究发现，TPEP能显著抑制经LPS诱导的RAW264.7体外抗炎细胞的炎性因子NO、PGE2、IL-6和TNF-α的表达，显示了良好的抗炎作用.但具体的抗炎机制还有待进一步研究.