红树蚬精巢发育的组织学研究和精子超微结构的观察

郭云鹏, 王公嗣, 黄 勃

(海南大学海洋学院，海南 海口 570228)

红树蚬(PolymesodaerosaSolander)是一类主要生长于热带红树林潮间带滩涂的一种大型双壳贝类动物，在广东、广西和海南等地均有分布.红树蚬生长速度快，体型较大，环境适应性强，有食用价值，具有养殖潜力[1].双壳类动物的经济价值已越发受到重视，目前有关双壳类动物生殖生物学的研究已有很多，然而对红树蚬繁殖生物学的研究只有少量报道.周浩郎等[2-3]研究了红树蚬性腺发育、生殖周期、自然分布和生长发育过程；张俊杰等[4]对红树蚬的人工养殖前景进行了研究.精子的超微结构是研究动物生殖发育的重要依据.黄勃等[5]研究了我国海域耳鲍精子的超微结构；周小龙等[6]对帘文蛤精子的超微结构进行了观察并且与其他双壳类动物的精子结构做了比较；焦海峰等[7]研究了软体动物精子的超微结构以及分类学意义.但至今为止, 国内外尚未见有关红树蚬精子超微结构的研究报道.本试验对雄性红树蚬的精巢形态和发育过程进行了研究，同时对其精子的超微结构进行了详细观察，旨在为双壳类动物的研究积累更多资料.

1 材料与方法

1.1 样本采集

红树蚬于2018年6—10月在海口市铺前镇采集，每月采集30个个体，红树蚬平均壳宽(32.9±3.7) mm，平均壳高(47.5±2.5) mm，平均壳长(50.3±1.9) mm，在装有人工海水的聚苯乙烯罐(980 mm×760 mm×680 mm)中暂养，每天喂食螺旋藻粉，3 d后选择雄性个体开始试验.海水盐度、温度和pH分别维持在22‰、24 ℃和7.8～8.0.

1.2 组织切片样本的制备与观察

快速取出精巢组织，剪成小块，用Bouin′s固定液固定，梯度浓度乙醇脱水，石蜡包埋，制成5～7 μm厚度的切片，再用苏木精—伊红(HE) 染色，中性树胶封片，DM1000型显微镜(德国徕卡微系统有限公司)观察.

1.3 透射电镜样本的制备与观察

快速取出精巢组织，剪取1 mm3的小块，用2.5%戊二醛缓冲液(4 ℃)固定过夜，1%锇酸固定2 h，梯度浓度乙醇脱水，Epon812环氧树脂包埋，LKB-Ⅱ型超薄切片机(瑞典LKB产品有限公司)切片，醋酸铀柠檬酸铅双重染色，JEM-1010型透射电镜(日本日立集团)观察拍照.

2 结果与分析

2.1 红树蚬精巢的形态和发育分期

精细胞：细胞圆形，核质浓缩，染色最深，位于滤泡中央，细胞形态在形成精子时发生明显变化，呈长锥形.

雄性红树蚬的生殖腺呈乳白色或乳黄色，位于足部上方，包裹着内脏团,由分枝状生殖管和滤泡组成，精细胞的发生主要在滤泡内进行.滤泡由滤泡壁和滤泡腔两部分组成，不同发育阶段的生精细胞排列成层，精原细胞和精母细胞的分布靠近基膜，而精子细胞和精子的分布靠近管腔.光镜下对精巢组织切面进行观察，可观察到不同发育阶段的生精细胞(图1).6—7月,精巢发育处于增殖和生长期，滤泡逐渐增大增多，间隙缩小.7—8月为成熟期，精巢体积大而饱满，内有大量生精细胞.8—11月为排放期，此阶段精巢持续排精，逐渐缩小，而后进入休止期.

精原细胞：精原细胞贴近滤泡壁，体积大，呈圆形或椭圆形，胞体直径约5 μm.胞质染色浅而均匀，核染色加深.

初级精母细胞：由精原细胞转化而来，呈圆形，胞质较少，染色加深.与精原细胞相比更加靠近滤泡腔.

次级精母细胞：次级精母细胞与初级精母细胞邻近，不易区分.胞质更少，染色深.

组织切片观察结果显示，精巢发育可分为以下5期.增殖期(图2A)：性腺开始形成，滤泡腔增大，滤泡壁伸展，滤泡腔壁主要由精原细胞组成.生长期(图2B)：性腺不断增大，滤泡数量增多，滤泡空隙不断缩小，腔内由精原细胞和精母细胞组成.成熟期(图2C)：性腺饱满，滤泡数量更多，滤泡腔更大;生殖上皮层增厚，滤泡壁可观察到精母细胞和精细胞向腔内分层排列;精细胞的数量不断增多，呈放射状占据滤泡腔.排放期(图2D)：排放后性腺颜色变淡，饱满度下降;滤泡之间再次出现空隙，精原细胞重新出现，排放后期滤泡中的成熟精子基本排空，剩余精细胞稀疏分布.休止期(图2E)：性腺萎缩，滤泡壁变厚，滤泡腔变空，有少量残存的精母细胞和精细胞.

2.2 红树蚬精子的超微结构

2.2.1 头部 红树蚬精子头部呈细长锥形，长度6～8 μm，由位于顶端的顶体及后端的精核组成.透射电镜下观察显示，顶体呈倒“V”字形，前部电子密度较大，顶体腔内电子密度较低.精核与顶体接触部位有一核窝，精核核长4～5 μm，由顶端至中部逐渐变粗，最宽处约为1 μm，精核具有很高的电子密度，同时可观察到不规则的染色较浅的核泡(图3A～3C).

2.2.2 中段 中段由中心粒和线粒体组成，可观测到由近端中心粒和远端中心粒组合而成的中心粒复合结构.精核与近端中心粒接触部位也有一核窝，两者相互垂直，而远端中心粒与精核长轴方向相同.横切面超微结构显示，精子线粒体呈圆球形，围绕中心粒排列在同一平面上，数量为4个，双层膜结构和嵴结构明显(图3D～3F).

2.2.3 尾部 尾部由鞭毛组成，靠近精核一端与远端中心粒相接触，横切面圆形，直径约0.4 μm，外层围绕不规则质膜层，内部为轴丝，由微管组成.微管呈典型的“9+2”结构，两根微管处于中央，四周围绕9对微管.纵切面超微结构显示，鞭毛壁及中心轴具有较高的电子密度(图3G～3I).

3 讨论

3.1 精巢发育过程

本研究观察结果显示：红树蚬增殖期精巢内以精原细胞为主，可见少量初级精母细胞；生长期和成熟期，精巢滤泡内含大量的精母细胞和精细胞；排放期后期，精巢中可见少量排精后留下来的精原细胞及增大的滤泡壁(图2).目前对双壳类动物性腺发育的研究，主要基于组织学的观察结果，并结合生精细胞的数量、比例及分布状况等特征进行分期[8-11].国内外大多数学者都将双壳类动物性腺发育分为5个时期：增殖期、生长期、成熟期、排放期和休止期[12-16].本研究观察结果显示，雄性红树蚬性腺的发育过程同样由上述5个时期组成.有研究表明，双壳类瓣鳃纲动物的精巢大多都属于滤泡型，滤泡内各期生精细胞均有生长，精原细胞位于滤泡壁上，不同阶段的生精细胞逐渐向腔内分布[14,16]，本研究观察结果显示，红树蚬也存在类似现象，这或许说明红树蚬的繁殖类型为多次繁殖型.

3.2 精子的超微结构

海洋软体动物精子的形态多样，主要区别在于精子头部精核、顶体部分的结构和所占比例.红树蚬精子的精核呈细长锥形，这与已报道的大部分双壳类动物精子的形状有很大不同，大部分软体动物精子的头部呈圆棒状，而帘文蛤的精核呈狭茧形，太平洋牡蛎呈钝圆型，香螺则呈线型[5-6,17-23].另外，红树蚬精核长6～8 μm，在头部中占据很大比例(图3B)，而其他软体动物的精核长度大都为1.5～3.0 μm，如角蝾螺精子核部的长度为2.5～2.6 μm[20]，魁蚶精核长1.5 μm[19].存在这种差别的原因可能与红树蚬的系统演化及种属差异有关[21]，精核的形态是区分种与种的重要标志之一，这一发现或可为蚬科种类的鉴别提供依据.本研究还观察到，红树蚬精核区域有不规则囊泡分布，直径为0.05～0.30 μm(图3C).Xia et al[24]认为，囊泡结构的出现反映精子受到了损伤；而孙慧玲等[25]认为，囊泡与精子内部的能量运输过程有关，属正常结构；本研究观察结果显示，绝大部分红树蚬精子都可发现囊泡结构的存在；周小龙等[6]对24种已报道的双壳类动物精子结构研究也指出，大多数双壳类动物的精子中均有囊泡.因此，可以认为囊泡的产生是一种自然现象.

双壳类动物精子的顶体多呈倒“V”字形，而青蛤精子的顶体呈帽状,栉孔扇贝精子的顶体则呈奶嘴形[6].本研究观察结果显示，红树蚬精子的顶体亦呈倒“V”字形，长度约为核的1/5，宽度与精核基本一致，顶体内有内含物质(图3A).研究表明，顶体的内含物质可能与协助精子入卵过程有关[7].软体动物不同种间精子顶体的特征差异较大，如贻贝精子的顶体部分明显突出，且长度为精核的两倍[18]，缢蛏的顶体具有长管状顶体柄[6]，而褶纹冠蚌的精子无顶体[7].红树蚬精子的顶体结构与其他贝类之间的区别是分析种间关系的一类重要依据.

线粒体为精子提供了运动的能量，是衡量精子运动能力的重要指标.中心体被认为能够加强鞭毛与核部的连接，从而辅助精子的运动.本研究观察结果显示，红树蚬精子线粒体个数为4个，同样存在中心体结构(图3D～3F)，与其他贝类精子中段的结构相似[17-20].不同种个体之间线粒体数量的不同反映了种间特异性的存在，同时说明了不同物种在生殖进化中的地位[21].双壳类动物精子的鞭毛结构有多种类型[7].同大多数双壳类动物的精子一样，红树蚬精子为单鞭毛型，鞭毛的主要结构为轴丝，有典型的“9+2”二联微管结构(图3G～3I).

4 结论

本试验对雄性红树蚬精巢的发育过程及不同阶段生精细胞的特征进行了组织学研究，总结了不同发育时期精巢的结构特点;同时利用透射电镜对精子的超微结构进行了观察，并与其他双壳类动物精子做了比较.本研究为进一步探究红树蚬的繁殖过程提供参考.