固相萃取-高效液相色谱法快速测定饮料中3种碱性橙含量

蔡燕斌 丁萍 刘月红

摘 要：目的：建立了一种固相萃取-高效液相色谱法快速测定饮料中的碱性橙2（chrysoidine G，CDG）、碱性橙21（orange G，AOG）和碱性橙22（astrazon orange R，AOR）共3种禁用色素添加剂的方法。方法：样品采用C18-SPE小柱净化，洗脱液在35 ℃下用氮气吹至近干后用定容液溶解并定容，过有机相滤膜后在Agilent XDB C18色谱柱上，以20 mmol·L-1的乙酸铵溶液和甲醇（体积比为35∶65）作为流动相进行分离，采用二极管阵列检测器（DAD）在449 nm波长处检测CDG，在485 nm 波长处检测AOG及AOR，以外标峰面积法定量。结果3种碱性橙染料在0.50～20.0 mg·L-1濃度范围内线性关系较好，方法回收率为86.8%～96.5%，相对标准偏差均小于2%（n=6），方法的检出限为0.01 mg·kg-1。结论：本方法操作简便、快速、准确，可适用于美年达和芬达等橙色饮料中碱性橙的检测。

关键词：高效液相色谱法;固相萃取;碱性橙染料;饮料

Abstract：Objective： To establish a SPE HPLC method for the rapid determination of three banned pigment additives in beverages， namelychrysoidine G （CDG） astrazon orange G （AOG）and astrazon orange R （AOR）. Methods： Samples were purified by C18-SPE small column， the eluate was blown to near dry with nitrogen at 35 ℃， dissolved and fixed volume with fixed volume solution， filtered by organic phase membrane， separated on Agilent XDB-C18 column with 20 mmol·L-1 ammonium acetate solution and methanol （volume ratio 35∶65） as mobile phase， and diode array detector was used for the determination of CDG at 449 nm and AOG and AOR at 485 nm with external standard method for quantification. Results： the linear relationship of the three basic orange dyes was good in the concentration range of 0.50～20.0 mg·L-1. The average recoveries were 86.8%～96.5% and the relative standard deviations were less than 2% （n=6）. The detection limits of the method were 0.01 mg·kg-1. Conclusion： The method is simple， rapid and accurate， and can be used for the determination of basic orange in orange drinks such as Mirinda， and Fanta.

Key words：High performance liquid chromatography; Solid phase extraction; Basic orange dye; Beverage

碱性橙染料是一类碱性工业染料，主要用于纺织品、木制品及皮革制品的染色，根据《中华人民共和国食品添加剂使用卫生标准》的相关规定，碱性橙染料是禁止用作食品添加剂的化学制品。由于碱性橙染料比柠檬黄、日落黄等水溶性染料更易上色且不易褪色，因此一些不法商贩将碱性橙染料用于黄鱼、辣椒、饮料和腐竹等豆制品的染色，以次充好，严重危害消费者的身体健康。

食品中禁用的碱性橙染料主要有3种，包括碱性橙2（CDG）、碱性橙21（AOG）及碱性橙22（AOR）。目前主要有高效液相色谱法（HPLC）[1]、反相高效液相色谱法（RP-HPLC）[2]和超高效液相色谱-串联质谱法[3]等检测方法。食品检测的国家标准主要是GB/T 23496-2009《食品中禁用物质的检测 碱性橙染料 高效液相色谱法》[4]，该方法中对于饮料等液体样品的前处理方法操作时间长、过程易损失，碱性橙染料回收率不好。本研究主要针对橙色饮料美年达、芬达和统一鲜橙多3种基质，采用固相萃取的前处理方法，用高效液相色谱法进行分离检测，建立一套简便、快速、准确的测定食品中碱性橙含量的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

美年达和芬达等液体样品均购自本地超市和市场。

1.2 仪器与试剂

甲醇、乙醇（色谱纯，上海安谱公司）;乙酸铵（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）;标准品碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22（纯度>88%，上海安谱公司）。所用试剂均为色谱纯，试验用水为一级水。Agilent1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）;氮吹仪（美国ORGANOMATION ASSOCIATES INC.）;固相萃取仪（美国Agela Technologies）;涡旋混合器（德国IKA）;电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 混合标准系列溶液的配制

①1 000 mg·L-1混合标准储备液。准确称取碱性橙2、碱性橙21和碱性橙22各约10 mg（按纯度折算为100%），用甲醇溶解并定容至10 mL。②100 mg·L-1混合标准中间溶液。取混合标准储备液1.0 mL，用定容液定容至10 mL。③混合标准系列工作溶液。将混合标准中间溶液用定容液逐级稀释，配制成浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg·L-1和 20.0 mg·L-1的混合标准系列工作液，现用现配。定容液为65%体积的甲醇和35%体积的0.02 mol·L-1乙酸铵溶液的混合溶液。

1.3.2 仪器工作条件

Agilent XDB C-18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相：A：0.02 mol·L-1乙酸铵溶液;B：甲醇;等梯度洗脱条件：A，35%;B，65%。流速：1.0 mL·min-1;柱温：40 ℃;检测波长：碱性橙2：449 nm;碱性橙21、碱性橙22：485 nm。进样量：20 μL。检测器：二极管阵列检测器（DAD）。

1.3.3 试验方法

将饮料样品混匀，称取10 g（准确至0.01 g）样品，过Cleanert S C18-SPE固相萃取柱（2 g/12 mL），弃去流出液，最后抽干，再加10 mL无水乙醇洗脱固相萃取柱，控制2滴/s的下滴速度，收集全部洗脱液至试管中，最后抽干小柱，在35 ℃下用氮气将洗脱液吹至近干，加入1.0 mL定容液，涡旋30 s溶解残留物，经0.22 μm滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中以备进样。按色谱峰的保留时间定性，以峰面积外标法定量。

2 结果与分析

2.1 洗脱液类型和体积的选择

分别采用10 mL乙醇、10 mL定容液、5 mL乙醇+5 mL定容液作为洗脱液，经过试验，发现由于定容液中有35%的水，所以10 mL乙醇氮吹干得最快，5 mL乙醇+5 mL定容液次之，10 mL定容液最慢，在液相上检测时用10 mL乙醇作为洗脱液3种碱性橙回收率最高，故用10 mL乙醇作为洗脱液。洗脱液乙醇体积分别为5、10、15 mL和20 mL时，试验结果见表1，结果表明，采用5 mL乙醇洗脱回收率不高，10 mL乙醇洗脱回收率较好，用15 mL乙醇和20 mL乙醇洗脱回收率与10 mL乙醇差不多，但因氮吹时间太长，故选用10 mL乙醇洗脱最佳。

2.2 氮吹温度的选择

分别选用20、30、35、40 ℃和50 ℃作为氮吹温度，经过试验，发现在20 ℃时氮吹时间较长，3种碱性橙回收率极不稳定，在40 ℃和50 ℃碱性橙2受温度的影响较大，在35 ℃时3种碱性橙回收率最高，试验结果见表2。故选用35 ℃作为氮吹温度。

2.3 最终定容溶液类型的选择

分别用1.0 mL甲醇和1.0 mL定容液作为最终定容溶液，经过试验，用1.0 mL定容液作为最终定容溶液，在液相中检测时3种碱性橙峰型较窄较好，峰高较高，用1.0 mL甲醇时峰型较宽较差，故选用1.0 mL定容液作为最终定容溶液。

2.4 样品调PH值的选择

芬达橙味碳酸饮料PH值在4左右，用稀氨水调节PH值至7左右，进行试验，结果表明，样品pH值在4左右时3种碱性橙2、21、22的回收率分别为89.5%、96.2%、94.5%，pH值在7左右时碱性橙2、21、22的回收率分别为88.7%、73.3%、68.8%，故样品采用不调PH值直接检测。

2.5 干扰试验

在色谱条件下，食品中常见的食用色素柠檬黄、日落黄、亮蓝、胭脂红、诱惑红和添加剂苯甲酸、山梨酸、糖精钠、咖啡因在449、485 nm处几乎无吸收，均不会干扰碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22的测定。

2.6 线性关系及检出限

对碱性橙2、碱性橙21、碱性橙22等3种碱性橙混合标准溶液系列进行测定，在0.5～20.0 mg·L-1浓度范围内峰面积与溶液浓度之间呈一定的线性关系，以信噪比为3（S/N=3）计算检出限，结果见表3。

2.7 回收率实验

按照试验方法对基底浓度分别为0的美年达和芬达分别进行测定，同时做加标回收实验，结果见表4。

3 结论

本研究采用固相萃取-高效液相色谱法对美年达和芬达2种饮料样品测定违禁添加色素碱性橙的含量，3种碱性橙染料在0.5～20.0 mg·L-1浓度范围内线性关系良好，方法回收率为86.8%～96.5%。该方法可适用于美年达和芬达等饮料样品中碱性橙染料的检测，同时具有操作过程简单、快速、稳定等优点。

参考文献：

[1]戚美静，杨冀艳，朱昌磊，等.高效液相色谱法测定食品中的碱性橙染料[J].食品安全质量检测学报，2016，7（6）：2523-2528.

[2]刘艳霞，尹建波，苏 芳，等.反相高效液相色谱法测定碱性橙Ⅱ[J].化学工程与装备，2014（5）：165-166.

[3]李 娟，丁晓明，刘丹丹，等.高效液相色谱-串联质谱法同时检测辣椒制品中4种工业染料[J].河南农业科学，2014，43（5）：130-133.

[4]中华人民共和国國家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 23496-2009 食品中禁用物质的检测 碱性橙染料 高效液相色谱法[S].北京：中国标准出版社，2009.