超声波辅助提取黄芪中总黄酮最佳工艺

李泽民 秦晓芳 李霞 田舒媛 张妍 王鑫

摘 要：目的：采用正交试验设计优化超声辅助提取黄芪总黄酮的工艺。方法：在单因素实验基础上，考察因素选定乙醇浓度、提取温度、料液比、提取时间等方面，考察指标是以总黄酮提取率为标准，应用正交法优选最佳提取工艺条件。结果：其最佳工艺条件为：乙醇体积分数60%，提取温度60 ℃，料液比为1∶25（g∶mL），提取时间为40 min，总黄酮提取率0.446%。

关键词：黄芪;黄酮;超声波法;正交法

Abstract：Ultrasonic assisted extraction of total flavonoids in Astragalus membranaceus was optimized by orthogonal experimental design. Methods： Based on the single factor experiment， the factors selected were ethanol concentration， extraction temperature， material-liquid ratio， extraction time， etc. The investigation indicators were based on the total flavonoid extraction rate. The orthogonal extraction method was used to optimize the optimal extraction conditions. Results： The best process conditions were： etanol volume fraction 60%， extraction temperature 60 ℃， material-liquid ratio 1：25（g∶mL）， extraction time 40 minutes， and total flavonoid extraction rate 0.446%.

Key words：Radix astragali; Flavonoids; Ultrasonic method; Orthogonal test

黄芪为豆科植物蒙古黄芪的根及膜荚黄芪的干燥根[1]，主要生产于我国的北方地区。黄芪是一种益气补虚作用的中药。现代药学研究表明，黄芪中含有黄酮类、多糖类、环黄芪醇类、皂苷类等多种生理活性成分[2]。在国内外的研究中发现，黄芪具有调节免疫力[3-6]、抑制肿瘤生长[7-10]、抗动脉粥样硬化[11]、降低血糖[12]、抗病毒[13]、治疗代谢紊乱[14]、迟发性神经退行性疾病以及延缓衰老[15]等作用。

黄酮类化合物的提取方式主要有有机溶剂萃取法[16]、超声波提取法[17]、微波萃取法[18]、酶萃法[19]、双水相提取法[20]和超临界萃取法[21]等。利用超声波提取法并设计正交实验，研究影响提取黄芪中黄酮类化合物的主要因素，对黄芪总黄酮的提取工艺条件进行不断的筛选，探求一种省时、省力、高效的黄芪总黄酮最佳提取工艺，对黄芪新型药品和功能食品的开发具有重要意义[22]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄芪（根状）、芦丁标准品、乙醇溶液、NaOH、NaNO3、NaNO2、Al（NO3）3·9H2O等均为分析纯品。

1.2 实验方法

1.2.1 黄芪总黄酮的提取

将黄芪样品用粉碎机搅碎，并将粉末过筛（60目筛），用石油醚连续脱脂3次，待脱脂完成后用烘干机干燥。称取0.50 g脱脂干燥黄芪粉末，放入100 mL的三角烧瓶中，加入一定量的乙醇，在一定条件下提取，过滤待检测。

1.2.2 标准曲线的绘制

（1）芦丁标准曲线的绘制。精确称取20 mg芦丁标准品，120 ℃干燥至恒重，选取70%浓度的乙醇进行溶解，并用100 mL容量瓶定容，摇匀即制成质量浓度为0.20 mg·mL-1的芦丁标准溶液。准备6个25 mL的容量瓶，各加入0.00、2.00、4.00、6.00、8.00 mL和10.00 mL芦丁标准液，再分别加入1 mL质量分数为5%的NaNO2溶液，摇匀静置5 min;继续各加入1 mL质量分数为10%的Al（NO3）3溶液，摇匀静置5 min;再分别加入4 mL质量分数为4%NaOH溶液，用70%浓度的乙醇溶液定容至25 mL，摇匀放置10 min;将70%乙醇溶液作为空白对照，测定其在510 nm波长的吸光度。得到线性回归方程为y=0.507 7x+0.041 1，R2=0.995 9。其中y为吸光度值，x为黄酮的质量浓度（μg·mL-1）。

（2）样品中总黄酮得率的计算。取适量黄芪样品提取液按1.2.2（1）中方法测定溶液中总黄酮的含量。按照公式（1）算出总黄酮得率。

（1）式（1）中，C-提取液总黄酮质量浓度，单位μg·mL-1;a-稀释倍数;V-提取液体积，单位mL;W-黄芪粉末质量，单位mg。

1.2.3 单因素实验

（1）超声功率对总黄酮得率的影响。在料液比1∶15，乙醇浓度40%，超声温度50 ℃，超声时间50 min，提取1次的条件下，对超声功率进行单因素实验。超声功率分别设定60、90、120、150 W和180 W，提取黄芪总黄酮含量并计算得率。

（2）料液比对总黄酮得率的影响。在超声功率120 W，乙醇浓度40%，超聲温度50 ℃，超声时间50 min，提取1次的条件下，对料液比进行单因素实验。料液比分别选取1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30，提取黄芪总黄酮含量并计算得率。

（3）超声时间对总黄酮得率的影响。在超声功率120 W，乙醇浓度40%，料液比1∶15，超声温度50 ℃，提取1次的条件下，对超声时间进行单因素实验。超声时间分别设定10、20、30、40 min和50 min，提取黄芪总黄酮含量并计算得率。

（4）超聲温度对总黄酮得率的影响。在超声功率120 W，料液比1∶15，乙醇浓度40%，超声时间50 min，提取1次的条件下，对超声温度进行单因素实验。超声温度分别选取40、50、60、70 ℃和80 ℃，提取黄芪总黄酮含量并计算得率。

（5）乙醇浓度对总黄酮得率的影响。在超声功率120 W，料液比1∶15，超声温度50 ℃，超声时间50 min，提取1次的条件下，对乙醇浓度进行单因素实验。乙醇浓度分别选取50%、60%、70%、80%和90%，提取黄芪总黄酮含量并计算得率。

1.2.4 正交试验设计

在单因素实验的基础上，选取乙醇体积分数、提取温度、超声时间和料液比作为考察因素，设计四因素三水平即L9（34）的正交试验，实验设计见表1。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 功率对总黄酮得率的影响

随着功率的增加，黄酮得率随其改变，当超声功率为120 W时，黄酮得率达到最大值，为0.359%;当功率继续增加时，黄酮得率逐渐降低。功率对总黄酮得率的影响见图1。

2.1.2 料液比对总黄酮得率的影响

为保证原料中的黄酮能完全转移至液相中并获得较高的提取率，料液比的选取极为重要。由图2可知，随料液比的增加，黄酮得率也随之变化。当料液比为1∶25（g∶mL）时，黄酮得率达到最大值，为0.438%;当料液比继续增加时，黄酮得率几乎无变化，所以最佳料液比为1∶25（g∶mL）。

2.1.3 超声时间对总黄酮得率的影响

超声时间会影响提取的传质过程，若超声时间过短，传质就不能达到平衡，其得率会偏低;当超声时间适宜，使传质达到基本平衡，得率最佳。综合时间效益，当提取时间为40 min时，传质基本达到平衡，黄酮得率较高，为0.387%。超声时间对总黄酮得率的影响见图3。

2.1.4 温度对黄芪总黄酮得率的影响

温度影响分子的扩散，为了增加溶质的扩散和溶剂的渗透，实验将超声温度作为考察指标，随着温度的升高，黄酮类化合物的得率随提取温度的升高而迅速增加，温度为60 ℃时提取率高达0.435%;但随着进一步升温，黄芪活性成分受损，出现大量杂质，使得后续步骤受到阻碍，综合考虑，选取超声温度为60 ℃。温度对总黄酮得率的影响见图4。

2.1.5 乙醇浓度对总黄酮得率的影响

随着乙醇浓度的增大，得率变化呈现先增加再减少的趋势。当乙醇浓度为60%时，黄酮得率最高，达到0.377%;随着乙醇浓度继续增加，得率略有减少。这是因为黄酮类化合物是一个具有广泛极性的物质群。加入一定量的乙醇，使总黄酮的醇溶性和水溶性得到最大程度的溶解。当溶液极性过高或过低时，会减少黄酮类化合物的溶解，导致总黄酮的提取率降低。所以最佳乙醇浓度是60%。乙醇体积分数对总黄酮得率的影响见图5。

2.2 正交试验结果与分析

单因素实验是只对一个因素进行实验，而将其他因素都固定，采用该方法的前提是必需假定各因素之间无交互作用。如果各因素间存在交互作用，利用这种方法结论方面会受到影响。由于试验中大部分因素对总黄酮提取率的影响不是单一的线性关系，而是一个综合的交叉影响，因此为了寻找黄芪总黄酮的最佳提取条件，在单因素实验的基础上，选用L9（34）正交表进行正交实验，结合单因素中黄酮得率的实验结果选取乙醇体积分数（A）、超声温度（B）、超声时间（C）和料液比（D）4个主要因素考察它们对总黄酮得率的影响。

由表2可知，总黄酮得率的影响程度各不相同，主次顺序为D>B>C>A，即料液比对总黄酮的得率影响最大，其次是提取温度，再次是超声时间，而乙醇体积分数对黄酮得率的影响最小。由k值确立的最佳组合为A2B3C3D3，即乙醇浓度70%、提取温度60 ℃、超声时间40 min、料液比1∶25（g∶mL）。由于乙醇浓度对总黄酮得率的影响最小，且考虑生产成本，故综合考虑选取的工艺条件为A1B3C3D3，即乙醇浓度60%、提取温度60 ℃、超声时间40 min、料液比1∶25（g∶mL），其总黄酮得率为0.446%。

3 讨论

黄芪是我国传统的补气良药。在保健品中，黄芪多与其他补益性中草药合用，起到保健作用[23]，因此对黄芪的功能特性进行研究，以期扩大黄芪的综合利用。总黄酮是一种很好的天然抗氧化剂，本实验采用超声波辅助提取工艺，运用单因素试验和正交试验研究超声功率、料液比、超声时间和超声温度等方面对黄芪总黄酮提取含量的影响。从效率和成本上考虑，该提取工艺简单可行，稳定性和重现性好。因为该方法可以节省大量的时间和溶剂，降低企业的生产成本，提高企业的经济效益，为该资源的开发利用提供有益的参考，并提供一些方法学依据。

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