TGF-β/Smad7信号通路在狼疮肾炎患者肾损害中的作用研究＊

王丽萍，王春燕，晏 红，贾旭强，张 钦

（1.兰州大学第二医院风湿免疫科，甘肃 兰州 730030；2.兰州大学第二医院病理科，甘肃 兰州 730030 3.定西市人民医院风湿内分泌科，甘肃 定西 743000；4.山西省运城市中心医院脊柱外科，山西 运城 044000）

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）是一种主要累及育龄女性，以多系统、多脏器损害为特征的全身性自身免疫病。流行病学研究表明，我国的 SLE 患病率为 0.03%～0.7%，据此估算，我国的SLE患者有近100万。由于自身抗体沉积靶器官及继发性血管炎导致器官功能障碍，SLE可以造成患者残疾甚至死亡，其中，由SLE疾病活动造成的肾脏损伤是SLE的重要脏器受损之一，影响预后，是风湿病领域的研究热点。对其发病机制的大量研究发现SLE患者存在多种免疫细胞 (B细胞、T细胞和单核细胞系等)的功能紊乱，导致多克隆B细胞活化、高球蛋白血症、自身抗体产生及免疫复合物的形成，究其根本原因为机体免疫耐受的丧失和免疫细胞的异常激活并对自身组织结构发生自身免疫反应。在免疫功能紊乱调节过程中诸多细胞因子及信号通路参与其中[1]。

近几年研究发现TGF-β/Smad信号通路具有重要的生理学活性,可能是肾脏纤维化进程中的调控因子，与原发性肾脏疾病的肾小球硬化进展中细胞外基质过度沉积有关，而狼疮肾炎患者发病中此信号通路所扮演的角色还鲜有研究。本课题将以狼疮肾炎 （Lupus nephritis,LN）为研究对象以期发现TGF-β/Smad信号通路在狼疮肾炎发病中的作用。

1 对象与方法

1.1 对象

本研究为前瞻性研究。筛选来自2016年8月～2018年8月定西市人民医院风湿内分泌科、肾内科和兰州大学第二医院风湿免疫科、肾内科住院的年龄18～50岁的60例狼疮肾炎、60例原发性肾小球肾炎患者，分别符合美国风湿病学会（ACR）1997年SLE分类标准[2]和肾活检确诊为原发性肾小球肾炎、狼疮肾炎的诊断标准。收集120例患者的血清、尿液、肾组织标本。所有肾活检患者均为术前当天晨起留取清洁中段尿5mL，离心分离2mL，取上清液后置于20℃冰箱中保存，标本于3个月内检测。纳入标准包括：年龄 18～50 岁，平均年龄 39.7±7.5 岁；所有患者均自愿参与试验并签署知情同意书。经筛选符合试验条件的受试者分别进入观察组、对照组，观察组）狼疮肾炎患者男 11 例(18.3%)，女 49 例(81.7%)，对照组—原发性肾小球肾炎患者男性14例（23.3%），女46 例（76.7%）。

2 方法

2.1 细胞培养

为了确定TGF-β和Smad7的作用，用Smad7模拟物、Smad7抑制剂转染之前或转染之后的Smad7培养肾组织细胞。用 RPMI-1640（Life Technologies，CA，USA） 做细胞培养液，Smad7 要取相同量的血浆中所分离的，肾组织细胞来自于肾活检患者提取的。

2.2 血清、尿液RNA分离

使用 TRIzol试剂（Takara，Dalian，China）分离来自外膜的总RNA

①培养细胞：外周血细胞 1-5×107，移入 1.5mL离心管中，加入1mL Trizol，混匀，室温静置5min；

②加入 0.2mL 氯仿，振荡 15s，静置 2min；

③4℃离心，12000g×15min，取上清；

④加入0.5mL异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min；

⑤4℃离心，12000g×10min，弃上清；

⑥加入1mL 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清；

⑦晾干，加入适量的DEPC H2O溶解（65℃促溶10～15min）。

2.3 RNA逆转录为miRNA cDNA和总cDNA

使用One Step PrimeScript miRNA cDNA合成试剂盒（Takara，大连，中国）和 PrimeScript RT试剂盒（Takara，大连，中国）。

2.4 定量RT-PCR分析 （qPCR）各组肾组织TGF-βmRNA、Smad7mRNA 表达水平

使用Applied Biosystems 7500快速实时PCR系统实 时 PCR 系 统 （Applied Biosystems，Carlsbad，USA）和 SYBR Premix Ex Taq（Takara，Dalian，China）根据制造商的说明通过qPCR检测mRNA和miRNA表达水平。并分别对GAPDH mRNA和小核RNA U6进行标准化。用2-ΔΔCt方法定量TGF-β和Smad7的Ct值。GAPDH内参照引物用DNA Club软件设计，TGF-β及Smad7引物分别参照文献[3]由上海生工生物工程公司合成序列如下。TGF-β上游引物为 5′CTTTAGGAAGGACCTGGGTT 3′，下游引物 5′CAGGAGCGCACAATCATGTT3'，扩增产物258 bp；Smad7 上游引物为 5′TCCTGCTGTGCAAA GTGTTC3′,下游引物为 5'AGTAAGGAGGAGGGGGA GAC3′, 产物为 164bp；GAPDH 上游 引物为 5′CTGGGC CGCTCTAGCCACCAA3′, 下游引物为 5′CTCTITGTATCACG CACGArITTC3′, 产 物 452bp。TGFβPCR 反应体系：5×PCR 缓冲液 5μL、MgCl2(25 mmol.L-1)O.5μl、dNTPs(10mmol.L-1)0.25μL、上游及 下 游 引 物 （25μmol.L-1） 各 0.5μl,cDNA 模 板3.5μl、TaqDNA 聚合酶(5 U.μL-1)0.5μL，补足双蒸水至 25μL；Smad7 PCR 反应体系：5×PCR 缓冲液5μl、MgCI2(25mmol.L-1)0.5μl、dNTPs(10 mmol.L-1)0.25μL、 上游及下游引物 （25μmol.L-1） 各 1μL、cDNA 模板 2.5μL、TaqDNA 聚合酶(5 U.μL-1)0.5μL，补足双蒸水至25μL。PCR扩增仪扩增，TGFβ条件为：94℃预变性 2 min，94℃变性 30s,50℃退火 30s,72℃延伸1 min,共循环30次，72℃终末延伸7min；Smad7改退火温度为52℃,其余与TGFβ相同。

2.5 免疫组织化学方法

SP法,采用一步法免疫组织化学法检测两组患者肾组织中TGF-β、Smad7的表达,简要检测步骤为:①肾组织标本行冰冻切片，厚为5 μm,经丙酮(4 C预冷)固定15-30min；②加入0.2%皂索室温放置30～45 min；③2%HO,室温作用 15 min 去除内源性过氧化物酶；④加人试剂盒中特异性多聚酶标记的鼠源单克隆一抗4工过夜。以上各步骤之间均使用含0.02%吐温-20的磷酸盐缓中液(PBS)洗海至少3次每次5 min；⑤加人二氨基联苯胺(DAB)应用液作用5～20 min,显微镜下终止显色，苏木素复染,封片,显徽镜下观察结果。同时设立阴性对照:分别PBS代替一抗,其余步骤不变。

2.6 采用ELISA法

检测血清和尿液中TGF-β、Smad水平，试剂由R&D公司提供,按1:100稀释，操作严格按照说明书进行。

2.7 肾活检

肾组织病理形态在B超引导下作经皮肾组织穿刺自动活检术取出肾组织，所取肾组织长度为10～15mm，光镜下观察均有5个以上肾小球。肾组织标本采用10%福尔马林液固定，石蜡包埋，制成2μm厚的切片，常规HE和PAS染色，由病理学专家根据诊断标准[14]作组织学诊断。

3 统计方法

采用SPSS20.0统计学软件行统计学分析，计量资料采用均数±标准差(±s)的形式表示，计数资料用构成比表示，计量资料采用t检验的形式(组间比较)。相关性分析用Cox回归分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

4 结果

1）ELISA法检测两组患者血清中TGF-β的含量，观察组较对照组含量高，P＜0.05，有统计学意义。（见表 1）

表1 两组患者血清TGF-β的含量（±s）

表1 两组患者血清TGF-β的含量（±s）

组别 OD 值 TGF-β（pg/mL）观察组 0.416±0.019 500.3±98.7对照组 0.579±0.019 274.9±11.5

2）ELISA法检测两组患者尿液中TGF-β的含量，观察组较对照组含量高，P＜0.01，有统计学意义。（见表 2）

表2 两组患者尿液中TGF-β的含量（±s）

表2 两组患者尿液中TGF-β的含量（±s）

组别 OD 值 TGF-β（ng/mgCr）观察组 0.489±0.090 405.3±239.7对照组 0.937±0.158 77.1±40.8

3）RT-PCR半定量分析结果：TGF-β、Smad7 mRNA表达观察组与对照组比较差异有显著性 (P<0.05)，（见表 3）。

表3 各组肾组织TGF-β、Smad7mRNA表达的半定量分析（±s）

表3 各组肾组织TGF-β、Smad7mRNA表达的半定量分析（±s）

组别 TGF -βmRNA/GAPDHmRNA Smad7mRNA/GAPDHmRNA观察组 1.55±0.78 0.83±0.04对照组 0.81±0.08 0.26±0.18

4）免疫组化半定量分析结果：患者肾组织TGF-β、Smad7蛋白主要表达在皮质肾小管上皮细胞内（如图1所示）。TGF-β、Smad7蛋白表达观察组较对照组均明显增强(P<0.05)（如图2所示，见表4）。

图1 肾组织TGF-β、Smad7蛋白主要表达在皮质肾小管上皮细胞内

图2 A对照组肾细胞TGF-β表达阴性对照,B观察组肾细胞TGF-β阳性表达,C对照组肾细胞Smad7表达阴性对照,D观察组肾细胞Smad7阳性表达

表4 两组肾组织，免疫组化的半定量分析（±s）

表4 两组肾组织，免疫组化的半定量分析（±s）

组别 TGF-β Smad7观察组 3.80±0.73 2.02±0.33对照组 0.32±0.14 0.48±0.05

5 讨论

众所周知，TGF-β是调节肾脏纤维化的一个主要细胞因子。TGF-β造成肾脏纤维化可能通过以下几种机制[4]：(1)减少了细胞凋亡；(2)直接使成纤维细胞或者其他类型细胞合成细胞外基质增多、分解减少；(3)促进其他类型的细胞转变为成纤维细胞，从而造成更多的细胞外基质(ECM)沉积，损伤肾组织。TGF-β对纤维化起着决定性作用，其下游信号分子也发挥着协同或者是拮抗的作用。目前Smad3信号蛋白在维化中所扮演的角色最为清楚明了，越来越多的研究证实Smad3在组织的修复和纤维化的过程中发挥着重要的作用，比如：伤口的愈合，上皮细胞转分化为间充质细胞以及各种肝脏、心脏、肾脏、皮肤、肺疾病过程中的瘢痕形成。TGF-β与胞膜上的TGF-β受体相结合后刺激Smad-3蛋白的基序SSXS磷酸化，并与Smad-2、Smad-4蛋白结合形成复合体，转运至细胞核内，通过3种方式 (直接与DNA结合、与其他DNA结合蛋白结合、与转录共激活子结合)调控转录，参与细胞生长、分化、凋亡[5]，在肾脏则表现为各型胶原、纤维连接蛋白、a—sma表达增加[6]，细胞外基质合成减少，分解增加，肾小管硬化，肾间质纤维化[7]。综上所述，现认为LN患者血清可刺激HK-2细胞分泌TGF-β，作用于细胞表面TGF-β受体，再经过细胞内的一系列信号转导，增加了纤维化信号通路上信号蛋白Smad3的磷酸化，相关表型蛋白表达增加，ECM沉积，肾脏纤维化。

以往的研究均表明，Smad4对Smads信号通路依赖型靶基因的激活至关重要，它是目前在哺乳动物中发现的唯-Co-Smads。Smad7在其他肾脏疾病中的表达有学者作过研究，但结果不尽相同。Fukasawa等[8]在大鼠肾梗阻模型(UUO)研究中发现，随着UUO大鼠肾小管间质纤维化的进展，Smad 7mRNA表达水平不断增高,而蛋白表达水平却降低，进一步研究显示,可能由于Smad的泛素调节因l、2(Smad ubiquitin regulatory factorsSmurfs)，也称 E3泛肽酶 (E3 ubiquitin ligases表)达水平增高,导致Smad7蛋白的降解和泛肽化活性显著增强。Uchica等[9]在肾小球膜增生性肾炎大鼠模型 (anti-Thylnephriti中s)发现 Smad7在肾小球表达降低，但Ostendorf等[10]却在相同的模型中得到了相反的。

国内王美美团队在狼疮鼠模型[11]的实验结果显示，慢性GVHD LN小鼠肾组织均检测到Smad4及Smad7mRNA和蛋白的表达，LN小鼠肾组织Smad蛋白及mRNA的表达均显著高于正常肾鼠模型组(P＜0.05)。对这一实验结果的可能解释：(1)以往她们团队的研究[12]在LN肾组织中TGF-β的表达水平显著增高,Smad4作为TGF-β下游信号传导的承担者，随着肾脏纤维化病程不断恶化和TGF-β表达增强而增强；另外，Smad7基因启动子区包含1个Smad3-Smad 4复合物的结合序列(GTCTAGAC)，因此TGF-β和Smad4表达水平增强会显著上调Smad7的表达；(2)近来研究发现，Smads信号通路的抑制物（如：SnoN和Ski等）在纤维化的肾脏中表达水平降低[13]，提示Smads抑制物表达的降低可能是肾脏纤维化中Smads表达增高的重要机制；(3)Smad7在LN肾组织中的表达增强，但内源性Smad7的表达却不足以抑制纤维形成反应，因为TGF-β对内源性Smad7表达的刺激不足以克服其活化R'Smads而产生的纤维化效应，对此的可能解释是Smad7表达的基本水平 （即使受到刺激时）能阻止R-Smads介导TGF-β效应，这一监控形成了一个内源性Smad7表达的刺激阈值，超过这一阈值则发生纤维形成反应[14]，而可能通过一个适当的载体系统（如：转染Smad7基因）[15]使 Smad7异位表达，这可能是治疗肾脏纤维化的一种手段。

本文通过细胞培养、ELISA、PT-PCR、免疫组化的检测均表明LV肾组织均有TGF-β、Smad7的表达，且表达高于原发性肾小球肾炎患者。这说明LN肾损害炎症因子参与的过程中，有TGF-β/Smad7这一信号通路的作用参与。LN病人TGF-β/Smad7异常是肾损伤产生的分子基础，并为LN免疫干预治疗提供理论依据。