柠檬酸钠还原法提取纳米金的改良与优化＊

金寿瑞,王东敏,马 婧,张兰兰，班雨婷

（西北民族大学医学院，甘肃 兰州 730030）

近年来，纳米材料在基础医学和生物医学工程领域取得了令人瞩目的成绩[1]，也因其独特的理化特性受到了医疗界的青睐[2]。纳米金是一种直径在1～100nm之间的金属材料，其不仅具有钠纳米材料的基本属性，还具有抗氧化性及杀菌、灭菌、抗腐蚀、促进新陈代谢等生物活性。纳米金的性质主要取决于金颗粒的大小及其表面特性[3]，纳米金的毒性与纳米金粒径关系密切，Anna等人[4]的研究显示：10～20nm范围内的纳米金对人体细胞无明显细胞毒性，因此，制备大小均匀、粒径可控的纳米金尤为重要。目前制备纳米金的方法包括化学法和物理法两大类，化学制备方法主要有氧化还原法、电化学法、紫外光分解法等[5-6]。物理方法主要有真空蒸镀法、电分散法、激光消融法等；本实验是在经典的柠檬酸钠还原法[7-10]基础上通过改变加热方式、保护剂种类、还原剂用量，旨在制备出粒径为10～20nm且分散性良好的纳米金。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

超纯水机 （上海和泰仪器有限公司）；水浴锅（上海博迅生物仪器有限公司）；电炉（220v-AC,0～1000W,天津心雨仪器仪表有限公司）；磁力搅拌器（上海越众仪器设备有限公司）；4℃冰箱 （海尔医用4℃冰箱）；透射电镜 （日本精工）；UV1100/75型紫外-可见分光光度计（上海现科）；恒温干燥箱（北京中兴伟业仪器有限公司）；高压蒸汽灭菌锅(三强医疗器械)，酸度计（塞多利斯科学仪器（北京）有限公司），电子天平（BP221S）。氯金酸（分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司）；柠檬酸钠；单柠酸；PVP；王水（分析纯，均购自成都市科龙化工试剂厂）。配置浓度为1%的氯金酸溶液、0.1%的PVP溶液、1%的柠檬酸钠、1%的单柠酸溶液，均放置于4℃冰箱中避光备用。

1.2 实验方法

实验室的室温为22.5℃，当地沸点为98℃，制备方法为柠檬酸钠还原法并分别从加热方式、保护剂、柠檬酸钠用量等方面进行部分改良，实验过程中所涉及到的试剂全部做避光处理。详细步骤如下：

1.2.1 加热方式

取100mL的锥形瓶和250mL锥形瓶各一个，分别编号1和2。1号瓶中加入超纯水50mL,2号瓶中则加入超纯水200mL,用移液管分别取1%氯金酸0.5mL和2mL于1号和2号瓶中，使氯金酸溶液终浓度为0.01%。1号瓶放入水浴锅中加热5min（水浴锅温度设为当地沸点温度），2号瓶则放在电炉上加热5min（电炉调至500W,使瓶中液体沸腾），加热后迅速取下分别各加入 1%柠檬酸钠溶液 4.0和16.0mL，均放在磁力搅拌器上搅拌3min(搅拌器调制600W)，然后再次分别用上述加热方法加热20 min,加热后再用磁力搅拌器上搅拌3min,后面以此法加热3min，搅拌20min重复4遍。上述操作过程中密切观察溶液颜色变化，第一次加热期间无颜色变化，当加入1%柠檬酸钠溶液并搅拌后1号瓶中液体颜色变为淡紫蓝色，2号瓶中液体颜色则变为黑紫蓝色，继续加热搅拌后两瓶溶液颜色均逐渐变淡，最终1号瓶液体颜色变为清亮明澈的橘红色，2号瓶中液体颜色变为透亮深紫蓝色，最后将两瓶冷却至室温，1号和2号瓶分别加入1%单宁酸0.1和0.4mL 摇匀保存。

1.2.2 保护剂

取3个规格为100mL的锥形瓶，分别编号为1,2,3。分别取1%氯金酸0.5mL加入锥形瓶，使氯金酸溶液終浓度为0.01%。同时将3只锥形瓶于水浴锅中加热5min（水温设为沸点温度），加热后取出，分别迅速加入3.4mL1%柠檬酸钠并用磁力搅拌器搅拌3min(搅拌器调制600W)，然后再取下用水浴锅加热20min,加热后再搅拌3min,后续加热3min，搅拌20min重复4遍。操作过程中观察，第一次加热期间瓶中液体均无颜色变化，当加入1%柠檬酸钠溶液并搅拌后瓶中液体颜色均变为淡紫蓝色，继续加热搅拌后溶液颜色均逐渐变淡，最终为清亮明澈的橘红色。最后取出冷却至室温，在2和3号锥形瓶中分别加入0.1mL1%单宁酸,0.1mL1%PVP作为保护剂。1号锥形瓶则不加任何试剂，因为柠檬酸钠本身就具有保护剂的作用。

1.2.3 柠檬酸纳用量

取6支100mL的锥形瓶，分别编号。各锥形瓶同时加入50mL超纯水和0.5mL1%氯金酸,将6只锥形瓶放入水浴锅中加热5min（水浴锅温度设为沸点温度），取出分别迅速加入1%柠檬酸钠3,3.2,3.4,3.6,3.8 和 4.0mL 并 用 磁 力 搅 拌 器 搅 拌 3min(600W)，然后取下用水浴锅加热20min,加热后搅拌3min,后续则加热20min，搅拌3min重复4遍，上述全过程中观察，第一次加热期间5min瓶中液体均无颜色变化，当加入1%柠檬酸钠溶液并搅拌后瓶中液体颜色均变为淡紫蓝色，继续加热搅拌后溶液颜色均逐渐变淡，最终为清亮明澈的橘红色。最后在这6个锥形瓶内分别同时分别加入1%单宁酸0,1mL作为保护剂。

上述所有制备的纳米金溶胶均采用目测法对其颜色进行描述、紫外-分光光度计测量吸光谱、透射电镜进行外观、粒径及分散程度的特征鉴定并分析上述方法差异。

1.3 实验结果表征

1.3.1 目测法

将上述制备好的纳米金溶胶避光保存至室温后分别装进同规格的透明试管中，按实验方法对试管编号。在外界环境相同的情况下，分别对各组纳米金溶胶进行目测观察。针对同组不同编号的纳米金溶胶的颜色差异比对分析，从而得出纳米金溶胶的色差与实验方法之间的联系。

1.3.2 紫外-分光光度计分析法

对所制备出的各组纳米金溶胶进行400～600nm全波长紫外-分光光度计测量吸光谱，对同组中纳米金溶胶的波峰高度、红移、蓝移现象分析比较。

1.3.3 透射电镜

将所制得的纳米金溶胶制样在烤灯下烤干，通过透射电镜对其进行外观、粒径及分散程度的特征鉴定并分各组纳米金溶胶的差异。

2 结果

2.1 加热方式的比较

加热的温度对于纳米金的制备起关键作用，电炉加热制得的纳米金溶液为紫红色，而水浴锅加热的纳米金颜色为橘红色（图1目测图）。明显电炉加热比水浴锅加热制备出的纳米金颜色深且偏紫；从（图1吸光图）可知水浴锅加热制备的纳米金的吸收峰比电炉加热制备的纳米金的吸收峰低，多次实验结果表明纳米金的吸收峰与加热温度的高低成正比；透射电镜图显示电炉加热制备出的纳米金的粒径比用水浴锅加热制备出的纳米金的平均粒径小，电炉加热制备的纳米金粒径在13±2nm，水浴锅加热制备的纳米金粒径在18±2nm（如图 1所示）。

图1 两种不同加热方式制备出的纳米金结果图

2.2 保护剂种类的比较

保护剂的种类不同对纳米金溶胶的颜色无影响（图2左上目测图）；三组纳米金胶体紫外可见分光光度计吸光值显示，分别用单宁酸或PVP作为保护剂相对用柠檬酸钠作为保护剂提取的纳米金，吸收峰值出现明显的蓝移现象（图2右上吸光图）；透射电镜结果显示三组纳米金粒径均匀，在15～17nm之间（图2电镜图）。

图2 不同保护剂制得的纳米金结果图

2.3 柠檬酸量的比较

当柠檬酸钠的用量控制在3.0～4.0mL之内时，纳米金胶体的颜色不会随柠檬酸钠用量的改变而改变 （图3目测图）；6组纳米金胶体的紫外可见吸收光谱最大吸收峰峰位均为520nm且各组的最大吸光度值不同，最大的吸光度值为0.126，此组柠檬酸钠用量为3.4mL（图3吸光图）。不同剂量柠檬酸钠制备的纳米金透射电镜显示6组粒径在16～20nm之间（图3电镜图），纳米金透射电镜粒径与柠檬酸钠剂量的回归统计分析P=0.475,还不能认为当柠檬酸钠剂量控制在3～4mL之间时对纳米金的粒径有影响。

图3 不同剂量（ml）柠檬酸钠制备出的纳米金结果图

3 讨论

实验表明，制备器具的清洁是纳米金制备成功的关键[10]。任何细微的杂质都会影响纳米金的粒径大小。因此，制备纳米金的所有玻璃仪器要在制备反应前经过严格的清洗程序。需经王水充分浸泡30min后，再用高纯水冲洗3遍，放入干燥箱中干燥30min后，备用。制备纳米金所需溶液均现配现用。

研究表明温度越高生成的纳米金颗粒的粒径越小，速度越快，数量也越多且均一性较好[11]由于加热方式的不同导致温度的不同，纳米金颗粒的生成速度也不同。电炉加热升温快且温度高，而水浴锅加热则升温慢温度低并且水浴锅所能达到最高温度还受当地海拔的影响。因此，电炉加热所制得的纳米金溶胶相对水浴锅制得的浓度高、颜色深、粒径小、且吸收峰高。

相关研究表示纳米金的吸收峰会随其粒径的增大而发生红移；且吸收峰的波长越长则合成的纳米金粒径越大[12]。由实验结果可知，该组纳米金的透射电镜图数据与紫外可见光吸光数据相矛盾。如果紫外可见光吸光数据正确，则此3组的纳米金透射粒径大小必定为PVP和单柠酸均小于柠檬酸钠。反之若此3组的透射电镜图正确，则紫外可见光吸光图中3组纳米金的吸收峰相近或是单宁酸和PVP作为保护剂值得的纳米金相对于柠檬酸钠自身作为保护剂值得的纳米金吸收峰出现轻微的红移现象。由理论来推论，纳米金的形成可分为两个阶段：第一个阶段是纳米金的形成过程，第二个阶段是纳米金的成长过程[13]。在这3组实验中保护剂分别是单宁酸、PVP、柠檬酸钠，前二者中每组均有两种保护剂同时起到保护作用，而柠檬酸钠本生虽可作为保护剂但其在该实验中的主要作用则是作为制备纳米金的一种试剂。在纳米金形成的整个过程中因为柠檬酸钠量是一定的，它在第一阶段随反应的进行而消耗，但第二阶段是就没有足量的柠檬酸钠来作为保护剂控制纳米金的形状及粒径。而利用单宁酸或PVP来作为保护剂制备的纳米金，虽然在第一阶段柠檬酸钠已消耗殆尽但在第二阶段又有新的足量的保护剂（单宁酸或PVP）加入。新加入的保护剂的亲水性集团保证了纳米金颗粒良好的分散性，不仅可以阻止纳米金颗粒的长大及团聚而且还使纳米金颗粒有较好的稳定性，由PVP或单宁酸为保护剂制得的纳米金颗粒粒径相对柠檬酸钠作为保护剂制得的纳米金小[14]。由此理论推论可知该组实验的紫外可见光吸光数据是正确的，透射电镜图中纳米金的粒径应为图2（右2＞左2≥右3）。 图2（右2）数据的错误可能与纳米金溶胶避光保存不良有光。由图2（左2、右3）的对比可看出用PVP作为保护剂制得的纳米金比用单宁酸作为保护剂值得的纳米金均一性，稳定性更好且纳米金外貌近球形。

由于氯金酸的计量增加会造成制备出的纳米金溶胶出现团聚现象，减少则会是金浓度降低。因此本组实验采用保持氯金酸的计量不变而逐梯度增加柠檬酸钠的计量。从该组纳米金的紫外可见吸收特征得知（图3吸光图），当柠檬酸纳计量在3.0～4.0mL范围内时，所得纳米金溶胶的最大吸收峰均为520nm，纳米金的透射电镜（图3电镜图）显示该组纳米金的粒径在15～20nm范围内。相关研究表示纳米金的吸收峰会随其粒径的增大而发生红移；且吸收峰的波长越长则合成的纳米金粒径越大[11]。此结论并在纳米金透射电镜图片中也得以证实。但不同剂量柠檬酸钠制备出的纳米金粒径与不同剂量柠檬酸钠的回归统计分析P=0.475,还不能认为当柠檬酸钠剂量控制在3～4mL之间时对纳米金的粒径有影响，这是由于样本量太少造成的，可以在后续的实验中增加样本量来证明柠檬酸钠剂量与纳米金粒径之间的相关关系。

4 结论

本实验通过在柠檬酸钠还原法的基础上进行改进，探索了不同因素对纳米金制备质量的影响，得出如下结论。温度越高生成的纳米金颗粒溶胶的粒径越小，速度越快，浓度越大。以PVP或单宁酸作为保护剂制备出的纳米金粒径均比以柠檬酸钠为保护剂制备出的纳米金粒径小。用单宁酸制备产量高，但是用PVP制出的纳米金分散性、均一性、稳定性更好。柠檬酸钠用量为3.4mL时制备出的纳米金溶胶浓度最大,而胶体金粒径与柠檬酸用量相关性不显著。当柠檬酸钠用量控制在 3.0～4.0mL时，制备出的纳米金粒径均在18±2nm之间。