小麦病程相关基因TaSec14的克隆及功能研究

牛欢 冯静云 黄建国 张超群 张露露 刘晓颖 王振英

（1. 天津师范大学生命科学学院，天津 300387；2. 天津市动植物抗性重点实验室，天津 300387）

小麦（Triticum aestivumL.）是世界上广泛种植的禾本科粮食作物之一，但各种病虫害的发生严重影响了小麦的产量，其中由布氏白粉菌（Blumeriagraminisf. sp.tritici）引起的小麦白粉病是危害严重的病害之一［1-2］。

Sec14p是一种广泛存在于真核生物中的磷脂酰肌醇转运蛋白（Phosphatidylinositol transfer proteins，PITPs）［3］，最早在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中被发现［4］，主要参与磷脂代谢和形成高尔基体分泌囊泡等过程［5-6］。最近发现，Sec14基因家族在植物响应逆境胁迫中发挥了重要的作用，Wang等［7］在拟南芥中过表达玉米Sec14p基因发现，转基因拟南芥的根长变短、种子萌发率下降，并且脯氨酸的积累减少，抗氧化酶活性下降，这一系列变化最终提高了转基因拟南芥对低温胁迫的耐受性。Kiełbowicz-Matuk等［8］在抗旱大麦中发现，HvSec14p蛋白能与大多数磷脂酰肌醇结合，且在渗透胁迫下转录水平明显增加。认为该蛋白可能通过参与细胞内磷脂酰肌醇的合成，增强抗旱大麦细胞膜的渗透能力。毛花英等［9］在甘蔗中克隆了Sec14基因，发现在聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）、盐、CaCl2和水杨酸（Salicylic acid，SA）胁迫下ScSec14基因表达均上调，推测ScSec14可能参与了Ca2+和SA介导的信号通路从而响应逆境胁迫。苏世超等［10］发现TaSec14p-5基因在小麦孕穗期的不同组织中组成型表达，并受盐、脱落酸（Abscisic acid，ABA）、干旱及低温胁迫的诱导。有关Sec14基因参与植物与病原菌互作的研究仅在烟草（Nicotiana tabacumL.）中有过报道，Kiba等［11］发现烟草被青枯菌（Ralstonia solanacearum）侵染后，NbSec14基因的表达上调，而沉默NbSec14后烟草对青枯菌的抗性降低，推测该基因可能与植物防御反应有关。在随后的研究中还发现，NbSEC14基因沉默植株中二酰甘油（Diacylglycerol，DAG）、磷脂酸（Phosphatidic acid，PA）的含量下降，磷脂酶C（Phospholipase C，PLC）、磷脂酶D（Phospholipase D，PLD）的活性降低；过表达NbSEC14植株的DAG、PA含量上升，PLC、PLD活性升高。认为NbSEC14蛋白可能通过参与磷脂代谢、调节磷脂酶活性，从而在烟草抗青枯菌的免疫反应中起重要作用［12］。目前，还未发现关于Sec14基因参与小麦与白粉菌互作过程的报道。

通过RNA-seq技术得到感病小麦品种京411中一段差异表达序列，根据该序列设计引物克隆了TaSec14基因。本研究利用生物信息学技术，分析TaSec14的基因结构和与其他物种Sec14的同源性。利用实时荧光定量PCR技术和VIGS技术分别分析TaSec14基因在不同抗性品种小麦接种白粉菌后的表达模式，以及降低该基因表达后感病小麦京411的抗病性变化，从而探究TaSec14基因在小麦与白粉菌互作过程中的作用，并为研究TaSec14基因功能提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

京411是半矮秆小麦品种，具有抗寒性强、分蘖力强、成穗率高等优点，是我国北部冬麦区高产广适育种的骨干亲本［13］，苗期对白粉菌侵染的表型为高感［14］。Brock是对白粉病具有强抗性的小麦品种，作为抗病遗传资源从英国引进，可能携带Pm2基因［15-16］。本实验室在前期研究发现，Brock的Pm2可能已经丧失了对白粉病病原菌的抗性，在Brock小麦的3BL上可能携带一个新的抗白粉病基因［17］。京 411×Brock抗白粉病近等基因系 BJ-1，该材料是以感病品种小麦京411为轮回亲本，以抗病品种小麦Brock为抗病基因供体，通过杂交获得F1代。之后再与感病品种小麦京411进行连续回交6代，每一代都在白粉菌胁迫下选取抗病植株，最后再自交1代后获得［18］。所用菌种为白粉菌生理小种E09，由中国农业科学院植物保护研究所提供。病毒材料为大麦条纹花叶病毒（Barley Stripe Mosaic Virus，BSMV）。

实验所用引物见表1，由金唯智生物科技有限公司天津分公司合成。

表1 引物序列

1.2 方法

1.2.1 小麦叶片cDNA和DNA的制备 根据Promega 公 司 Eastep®Super Total RNA Extraction Kit中的方法提取京411品种小麦叶片总RNA，用1%琼脂糖凝胶电泳分析RNA完整性，Nanodrop1000紫外分光光度计检测RNA的浓度和质量。按照Promega公司M-MLV Reverse Transcriptase中体系以oligo（dT）18作为反转录引物，京411品种小麦总RNA为模板合成cDNA。使用天根公司Plant Genomic DNA Kit中的方法提取京411小麦基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳分析样品完整性。

1.2.2TaSec14基因的克隆及序列分析 根据RNASeq结果设计引物SecCDS-F/R，以京411小麦cDNA为模板，扩增差异表达序列。体系为：5×PSGXL Buffer 5 μL，dNTP 2 μL，SecCDS-F 0.5 μL，SecCDS-R 0.5 μL，cDNA 0.25 μL，Prime STAR GXL 0.5 μL，灭菌水 15.5 μL。反应程序为 ：94℃ 5 min ；35 个循环 ：98℃ 10 s，58℃ 15 s，68℃ 1 min 15 s；68℃ 7 min；4℃保存。回收目的基因并和pGEM-TEasy构建重组载体后送公司测序。将测序结果上传至NCBI中的保守结构域数据库（Conserved domain database，CDD）分析其结构域。将基因序列上传至NCBI GeneBank进行Blastx比对，查找与其相似度高的基因。再利用DNAMAN软件将该基因的氨基酸序列与其他物种氨基酸序列进行比对，通过MEGA软件构建系统进化树，分析其同源性。

根据cDNA序列设计DNA扩增引物SecFlth-F/R，以京411的DNA为模板进行扩增。体系为：5×PSGXL Buffer 5 μL，dNTP 2 μL，SecFlth-F 0.5μL，SecFlth-R 0.5 μL，DNA 1 μL，Prime STAR GXL 0.5 μL，灭菌水 15.5 μL。反应程序为：94℃ 5 min；35个循环 ：98℃ 10 s，58℃ 15 s，68℃ 2 min ；68℃ 7 min；4℃保存。按照与cDNA相同的方式测得目的基因的DNA序列，并用IBS 1.0.2软件绘制基因结构示意图。

1.2.3TaSec14基因在白粉菌胁迫下的表达模式分析 京411、BJ-1和Brock幼苗长至一叶一心期时，采用抖佛法将新鲜的白粉菌孢子均匀接种于小麦第一叶表面。分别对接种不同时间点（0、2、4、8、12、24和48 h）的不同品种小麦第一叶进行取材，剪取叶尖1/3部位3 cm，放于灭菌且经液氮低温处理过的2 mL EP管中，-80℃超低温冰箱保存。按照1.2.1中的方法获得小麦cDNA，并根据cDNA非保守区域序列设计引物SecQ-F/R，以小麦TaActin基因为内参，根据上海罗氏制药有限公司Fast Start Universal SYBR Green Master（ROX）设计实时荧光定量PCR反应体系：SYBR Green Mix 10 μL，cDNA 1 μL，SecQ-F 1 μL，SecQ-R 1 μL，无菌水 7 μL。每个样品设置3个生物学重复。利用7500 Fast Real-Time PCR System进行扩增，程序为：50℃ 2 min；40 个循环 ：95℃ 10 min，95℃ 15 s，58℃ 30 s。反应完成后进行溶解曲线分析，以确定引物的特异性。将样品扩增的Ct值进行汇总，采用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量，将3个重复得到的相对表达量数据计算平均值作为最终结果，并用Origin 9软件绘制TaSec14基因的相对表达量图。

1.2.4TaSec14基因的VIGS分析 根据TaSec14基因非保守区序列设计特异性沉默引物 SecV-F/R，以感病小麦京411的cDNA为模板扩增沉默片段。使用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析，回收沉默片段后与BSMVγ∶载体骨架构建重组载体BSMVγ∶TaSec14。

提取含有病毒载体的质粒BSMVα、BSMVβ、BSMVγ∶GFP、BSMVγ∶PDS以及 BSMVγ∶TaSec14，经线性化、酚仿抽提纯化后，参照普洛麦格公司RiboMAX TM Large Scale RNA Production System-T7试剂盒对BSMV病毒进行体外转录，获得病毒RNA。配制摩擦接种工作液：混合BSMVα、BSMVβ、BSMVγ∶GFP各组分RNA作为BSMV∶GFP阳性对 照 组；混 合 BSMVα、BSMVβ、BSMVγ∶PDS各组分RNA作为BSMV∶PDS阳性对照组；混合BSMVα、BSMVβ、BSMVγ∶TaSec14各组分 RNA 作为BSMV∶TaSec14实验组。等体积混合灭活的DEPC水和GKP Buffer作为空白对照组。待感病小麦京411长到第二叶完全展开时，将工作液以8 μL每份的剂量摩擦接种至叶片上。

1.2.5TaSec14基因沉默效率验证 首先对沉默体系的有效性进行检验，由于PDS基因是高等植物合成类胡萝卜素的关键基因，该基因的缺失将导致植株叶片白化，故对摩擦接种后BSMV∶PDS对照组叶片的白化情况进行观察，验证沉默体系的有效性。待GKP Buffer对照组、BSMV∶GFP对照组和BSMV∶TaSec14实验组植株第三叶完全展开时，按照1.2.3中的方法接种白粉菌，并分别对接菌0 h和4 h各组植株的第三叶进行取材。按照1.2.3方法提取各样品总RNA后反转录成cDNA，每个样品进行3个生物学重复，利用实时荧光定量PCR技术和2-ΔΔCt法得到各组植株叶片TaSec14基因的表达量，将3个重复样品得到的相对表达量求均值后计算TaSec14基因的沉默效率，计算方法为：

TaSec14基因的沉默效率=（1-BSMV∶TaSec14实验组中TaSec14基因的表达量/GKP Buffer对照组中TaSec14基因的表达量）×100%

之后采用t检验法检测实验组与对照组的差异情况，将TaSec14基因的相对表达量和差异情况利用Origin 9软件绘图。

1.2.6 敲减TaSec14基因后的白粉菌细胞形态学观察和统计分析 按照1.2.3取材方法，对接种白粉菌2 d、3 d和7 d的GKP Buffer对照组、BSMV∶GFP对照组和BSMV∶TaSec14实验组植株第三叶进行取材。经脱色固定、考马斯亮蓝R-250染色后，用共聚焦显微镜观察叶片上白粉菌孢子的发育情况。统计接种白粉菌24 h后BSMV∶GFP对照组和BSMV∶TaSec14实验组植株叶片上的白粉菌分生孢子、喙型附着胞和畸形附着胞（分瓣型和纤细型）数目，每个样品的白粉菌数目统计3次求平均值作为样本值。根据公式计算白粉菌的成功侵染率和畸形比率，分析基因沉默后小麦对白粉菌抗性的变化。

计算方法为：

白粉菌孢子成功侵染率=喙型附着胞/（喙型附着胞+畸形附着胞+分生孢子）×100%；

白粉菌畸形孢比率=畸形附着胞/（喙型附着胞+畸形孢+分生孢子）×100%。

2 结果

2.1 TaSec14基因的生物信息学分析

克隆得到该基因的cDNA全长序列（1 564 bp）和DNA全长序列（2 186 bp），利用APE软件预测其开放阅读框为1 212 bp，编码403个氨基酸，如图1所示。利用IBS 1.0.2软件绘制基因结构示意图，该目的基因含有两个主要的结构域，即结合脂质的CRAL_TRIO_N结构域和具有磷脂酰肌醇转运功能的SEC14结构域（图2-A），该基因包括5个外显子和4和内含子，呈间隔排布（图2-B）。

Blastx比对结果显示该基因与二穗短柄草（Brachypodium distachyon，Bd）、 玉米（Zea mays，Zm）、水稻（Oryza sativa，Os）、黍（Panicum hallii，Ph）、 枣（Ziziphus jujuba，Zj）、 蓖麻（Ricinus communis，Rc）和可可（Theobroma cacao，Tc）中Sec14蛋白家族的相似性较高，分别为80.45%、76.75%、72.38%、68.67%、67.31%、65.80% 和61.96%。利用DNAMAN软件将该基因的氨基酸序列与其他7个物种氨基酸序列进行比对分析，结果如图3所示，几个物种Sec14结构域部分的相似性高，说明其具有较高的保守性。系统进化树分析表明该基因编码的蛋白与多个物种中的SEC14蛋白有亲缘关系，且与二穗短柄草PITP3蛋白（XP_010236107.1）的亲缘关系最为接近（图4），说明其属于Sec14蛋白家族，故将该基因命名为TaSec14。

2.2 白粉菌胁迫下TaSec14基因的表达模式分析

以小麦TaActin作为内参基因，分析接种白粉菌后3个小麦品种中TaSec14基因的表达模式（图5）。发现在感病小麦京411中TaSec14基因的本底表达量最高，接种白粉菌之后表达量上升，在8 h达到一个高峰，之后开始下降，24 h再次达到高峰，之后再次下降。在抗病小麦BJ-1中，TaSec14表达量在接种白粉菌后开始上升，4 h达到高峰，之后开始下降，12 h后再次升高。在抗病小麦Brock中，TaSec14的表达量在接种白粉菌后先上升，8 h达到峰值，之后开始下降，在24 h后又有小幅上升。在感病小麦京411及其近等基因系BJ-1中，TaSec14基因的表达量一直高于抗病小麦Brock，并且在近等基因系BJ-1中的表达趋势也和轮回亲本京411相似。

2.3 TaSec14基因沉默体系构建

利用特异性沉默引物SecV-F/R扩增TaSec14基因片段，然后与BSMVγ∶载体骨架构建BSMVγ∶TaSec14重组载体。待各组植株第三叶完全展开后，对其进行摩擦接种。图6是各组叶片的表型观察结果，BSMV∶PDS对照组的叶片白化明显，说明PDS基因被有效沉默，体系构建成功。

实时荧光定量PCR检测各组TaSec14基因转录水平变化，结果如图7所示，发现与对照组相比，接种病毒RNA后，实验组TaSec14的表达水平在0 h时的沉默效率为85%，在4 h时的沉默效率为90.5%，并且t检验结果表明实验组中TaSec14基因的表达量与对照组的差异均达到极显著水平，说明小麦内源基因TaSec14的表达被有效抑制。

图1 TaSec14基因序列信息

图2 TaSec14基因结构示意图

2.4 TaSec14基因敲减后影响白粉菌孢子发育

图3 TaSec14同源序列比对结果

图4 TaSec14系统进化树分析结果

图5 TaSec14基因在白粉菌侵染下的表达模式分析

对基因敲减后感病小麦京411接种新鲜的白粉菌孢子，观察接种2 d、3 d和7 d后各组小麦植株的第3叶，统计叶片上白粉菌孢子的生长发育情况，图8是接种白粉菌孢子不同时间后细胞生长发育情况。接种白粉菌2 d后，BSMV∶TaSec14实验组叶片上多数为未侵染成功的畸形附着孢，仅可以看到少量的喙型附着胞（图8-C），而在GKP Buffer对照组（图8-A）和BSMV∶GFP对照组中，已经出现了初级菌丝（图8-B）；接种白粉菌3 d后，BSMV∶TaSec14实验组中才出现初级菌丝（图8-F），而在另两个对照组中菌丝已经伸长，个别视野下还发现了念珠状的孢子（图8-D-E）；接种白粉菌7 d后，两个对照组中均出现了大量的念珠状孢子和遍布视野的次级菌丝（图8-G、H），而这时BSMV∶TaSec14实验组才开始有次级菌丝形成，没有观察到念珠状孢子（图8-I）。

图6 TaSec14基因沉默后各组植株叶片的表型观察结果

图7 TaSec14基因沉默效率验证

对每个样品叶片上白粉菌孢子数目进行统计3次，求平均值作为样本值。根据1.2.6中公式计算接种白粉菌24 h之后GKP Buffer对照组和BSMV∶TaSec14实验组上白粉菌孢子的成功侵染率和畸形率，结果如图9所示。BSMV∶TaSec14实验组白粉菌的成功侵染率为35.92%，略低于GKP Buffer对照组的39.31%，白粉菌孢子的畸形率为11.27%明显高于对照组的4.05%，并且BSMV∶TaSec14实验组中白粉菌孢子的侵染率和畸形率与GKP Buffer对照组相比，差异均达到了显著。以上结果表明，降低TaSec14基因的表达导致感病小麦京411对白粉菌抗性的增加。

图8 白粉菌胁迫下各实验组的白粉菌细胞形态学观察

图9 白粉菌细胞形态学统计

3 讨论

3.1 TaSec14属于磷脂酰肌醇转运蛋白

Sec14结构域是一种高度保守且古老的脂质结合结构域，由酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sec14p进化而来，在亚细胞器和细胞运输中执行复杂的调节功能［19］。Sec14基因家族编码的蛋白参与植物非生物胁迫信号转导［20］、脂类的运输和代谢［21］、磷脂酶C调节的信号转导等生理过程［22］。本研究克隆了一个在感病小麦京411中特异表达的TaSec14基因，含有典型的SEC14保守结构域，属于磷脂酰肌醇转运蛋白家族的成员。

3.2 敲减TaSec14基因改变京411对白粉菌的敏感性

VIGS是一种基于RNAi的对植物特定内源基因进行沉默实验的技术［23］。由于植物体内存在能识别外源RNA并将其降解的免疫机制［24-25］，该技术利用该免疫机制，向植物体内转化人工改造的病毒载体，完成对基因的沉默。利用VIGS技术敲减京411中的TaSec14基因后，发现接种白粉菌24 h后BSMV∶TaSec14实验组的白粉菌孢子成功侵染率低于GKP Buffer对照组，畸形率高于对照组。表明抑制TaSec14基因的表达能一定程度上提高感病小麦京411对白粉菌的抗性。

3.3 TaSec14基因在小麦与白粉菌互作中起到调控作用

本研究克隆的TaSec14基因属于Sec14基因家族，在接种白粉菌后，TaSec14在感病小麦京411及其近等基因系BJ-1中的表达量一直高于抗病小麦Brock，降低京411中的TaSec14基因表达后，BSMV∶TaSec14实验组白粉菌的成功侵染率低于GKP Buffer对照组，并且畸形率明显高于对照组，即降低内源TaSec14基因的表达能在一定程度上增加感病小麦京411抵御白粉菌侵染的能力。因此推测，TaSec14基因可能在小麦与白粉菌互作过程中起到一定的作用。Sec14蛋白家族可以介导磷脂酰肌醇的代谢并参与二酰甘油-蛋白激酶C（Diacylglycerol-Protein kinase C，DAG-PKC）途径［26］。在最新的一项研究中发现［27］，稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）的附着胞内存在一个组氨酸-天冬氨酸激酶Sln1膨压感受器，当Sln1感受到阈值范围内的膨压后，能通过PKC依赖性的途径发挥作用，磷酸化NADPH氧化酶或调控蛋白激酶A（Protein kinase A，PKA）途径，从而共同调节附着胞膨压和入侵栓的形成，参与水稻与稻瘟病菌的互作过程。由此发现，Sec14与Sln1都介导了PKC途径，参与了磷脂酰肌醇信号通路，且最终都影响了植物与病原菌的互作过程。我们推测，TaSec14蛋白也有可能通过PKC途径影响其他多元醇的合成，从而参与小麦与白粉病互作过程。本实验对TaSec14基因功能的分析可为Sec14基因家族的研究提供新的依据。

4 结论

本研究克隆得到了普通小麦中的TaSec14基因，该基因含有典型的SEC14家族保守结构域。接种白粉菌后，感病小麦京411及其近等基因系BJ-1中TaSec14基因的表达量一直高于抗病亲本Brock，且在BJ-1中的表达趋势与轮回亲本京411趋同。通过VIGS技术敲减京411中的TaSec14基因发现，降低京411内源TaSec14基因的表达能在一定程度上增加其对白粉菌的抗性。推测TaSec14基因可能在小麦与白粉菌互作过程起到了调控作用。