拟南芥EBP1蛋白与RNA相互作用的初步研究

李晓燕 李驰宇 于峰 廖红东

（湖南大学生物学院，长沙 410082）

基因表达调控是分子生物学研究的重要领域，主要包括转录调控、转录后调控、mRNA翻译、翻译后调控4个方面［1］。随着RNA-seq、RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecipitation，RIP）、紫外交联免疫沉淀（Crosslinking-immunprecipi tation，CLIP）等技术的成熟，RNA转录后调控机制成为新的研究热点［2］。转录后调控包括RNA包装加工、RNA可变剪接、RNA定位、RNA稳定性、RNA翻译等过程［3］，每个环节都需要RNA结合蛋白（RBPs）的参与调节［4］。RBPs广泛存在于微生物、植物、动物体内［5］。在微生物中，普城沙雷氏菌G3的RNA结合蛋白Hfq（a host factor for RNA phage）促进YadA（Yersinia adher-ence protient）和InvA（Invasion on associated protein）mRNA与核糖体的结合，进而促进了两种粘连蛋白YadA和InvA的产生，增强菌体的适应性［6］。在植物中，RNA结合蛋白HOS5（High Osmotic Stress Gene Expression 5） 结 合RS40（Serine/arginine-rich proteins） 的 前 体 mRNA， 调节其可变剪切，确保水稻对盐胁迫的耐受［7］；甘氨酸富集的RNA结合蛋白AtRZ-1b结合FLC（Flowering Locus）的mRNA促进FLC第一个内含子高效剪接从而促进拟南芥植物开花［8］。在动物中，人类线粒体RNA结合蛋白C6orf203抑制OXPHOS（Oxidative phosphorylation）mRNA 与 核糖体结合，进而抑制OXPHOS蛋白的合成［9］。直肠癌细胞RNA结合蛋白HUR（Hu antigen R）通过肠上皮的核仁磷酸蛋白调节Rac1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1）mRNA 的 核 质 穿 梭［10］。另 外，EBP1蛋 白 通 过 与AR（Androgen receptor）mRNA 3'-UTR富含UC的motif相互作用，促进ARmRNA的降解，同时EBP1还与ARmRNA 5'编码区的CAG茎环结合，抑制AR的翻译，从而抑制前列腺癌细胞的生长［11］。

EBP1是受体酪氨酸激酶ErbB3（Erythroblastic leukemia viral oncogene homolog）的磷酸化底物，是调控动植物生长发育、应激反应重要的DNA和RNA结合蛋白。在动物中，EBP1作为DNA结合蛋白与E2F1（E2F transcription factor1）基因的启动元件相互作用，抑制E2F1基因转录，进而抑制细胞生长［12］。另外，EBP1也可作为RNA结合蛋白，以核糖核蛋白的形式发挥功能，不仅参与不同种类rRNA的成熟过程［13］，也可以绑定mRNA并调控其翻译。例如，人类EBP1蛋白通过富含赖氨酸的基序361SASRKTQKKKKKKAS375与口蹄疫病毒的核糖体进入位点（The internal ribosome entry site，IRES）相互作用，促进48S起始复合物的形成［14］；EBP1也可以通过σ70-like motif（46-54氨基酸）结合5S rRNA，调控其成熟过程［15］。EBP1蛋白在动物和植物中结构和功能高度保守，已有报道EBP1在植物中也可以直接绑定DNA［16］。拟南芥EBP1蛋白直接绑定CML38启动子片段，抑制CML38基因表达［16］。最新质谱结果显示拟南芥EBP1参与核糖体生物生成、蛋白质翻译等过程，可以绑定mRNA、rRNA、snoRNA、tRNA等多种RNA［17］。但已报道的EBP1的靶基因甚少，EBP1绑定RNA的结构域、参与转录后调控具体机制目前仍不清楚。本研究通过RNAEMSA（RNA electrophoretic mobility shift assay） 等实验证实EBP1体外结合RNA，并通过生物信息学预测了EBP1结合RNA的结构域，RIP实验找到 了 3个靶基 因 RNA（AT1G24792、AT3G25211、AT3G24320）。为了研究EBP1对靶RNA的转录后调控，虫草素处理实验发现，EBP1促进AT1G24792、AT3G24320的mRNA的降解，而对AT3G25211的mRNA稳定性没有影响。通过核糖体提取实验发现EBP1抑制AT1G24792、AT3G24320的mRNA与核糖体结合，而促进AT3G25211的mRNA与核糖体结合。以上实验结果表明，拟南芥EBP1作为一个RNA结合蛋白，参与调控下游靶基因mRNA稳定性与翻译速率，为研究该蛋白的生物学功能提供了新的方向。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料 拟南芥野生型Col-0、ebp1-1（SALK_030408）、ebp1-2（SALK_052695）、ebp1-3（CS854731）、35S∷EBP1-GFP植物材料以及EBP1-pGEX-4T-1 BL21的菌种由中南大学生命科学学院李驰宇提供。将拟南芥种子经表面消毒后，点播在pH为5.8、含0.8%琼脂的1/2 MS固体培养基上，4℃春化3 d后，于22℃，长日照（16 h光照/8 h黑暗）垂直放置培养7 d进行后续实验。

1.1.2 主要试剂 GST-Resin（货号：B074B）购于徐州博天生物有限公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖（IPTG）（货号：A100487-0005）、卡那霉素（货号：A506636-0025）以及氨苄青霉素（Amp）（货号：410V033）、还原性谷胱甘肽（货号：A100399-0025）、PMSF（货号 ：4100745-0005）均购于生工生物工程上海有限公司；Protein GFP Trap（货号：SA070005）购于常州天地人和生物有限公司；蛋白酶抑制剂（货号：B14001）、磷酸酶抑制剂（货号：B15001）购于Selleck Chemicals；RNA酶抑制剂（货号：N251A）、SYBR PremixTaqkit（货号 ：SQ121）均购于一诺唯真生物公司，Thermo逆转录试剂盒（货号：K168）；FITC修饰探针擎科生物公司合成，其他生化试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析 EBP1一级结构域预测：将 TAIR网 站（https：//www.arabidopsis.org/）查 找的拟南芥EBP1（AT3G51800）的氨基酸序列导入Pfam网站（http：//pfam.xfam.org）预测EBP1蛋白质结构域。EBP1晶体结构预测：将EBP1氨基酸序列 输 入 Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2）网站进行EBP1晶体三维结构预测分析，通过PyMOL软件进行颜色、结构旋转等修饰。RNA多序列比对分析：利用NCBI网站（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 的BLAST功 能， 以“GUCUCUCACUGCGACGGCUU”序列为模版，进行RNA多序列比对，获得包含此RNA序列的潜在靶基因，并下载包含“GUCUCUCACUGCGACGGCUU”长度为60 bp的潜在靶mRNA序列，用Clustal X软件（Invitrogen公司）进行Alignment比对（参数为Multiple Mode Alignment、Font size10）导出 Fasta文件，再用Bio-Edit进行颜色、字体、间距的美化。RIP实验引物设计：在TAIR网查找以上潜在靶基因的cDNA，再通过Primer Premier 5软件设计包含潜在结合区域的引物，于擎科生物公司合成，用于后续实验（引物列表见表1）。

1.2.2 EBP1-GST蛋白诱导 将包含EBP1-pGEX-4T-1或pGEX-4T-1的BL21大肠杆菌蛋白表达菌株，以1∶1 000的比例接种于5 mL LB液体培养基中（含100 μg/mL Amp）中，37℃，200 r/min 培养 12-16 h 后，以1∶100接种于200 mL含有100 μg/mL Amp的LB液体培养基中，37℃，200 r/min培养，至OD600=0.8，加入工作浓度为0.5 mmol/L的蛋白表达诱导剂IPTG，28℃，100 r/min诱导6 h。

1.2.3 GST蛋白纯化 将诱导好的EBP1-GST菌液分装于50 mL离心管，4℃，5 000 r/min离心10min，去除上清。加入7 mL蛋白裂解缓冲液（50 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L PMSF，pH 7.5）重悬菌体，冰上超声破碎EBP1-GST菌体（功率200 W，超声6 s，冷却9 s，重复破碎约15 min至裂解液澄清）。超声破碎后的悬液于4℃，6 000 r/min离心5 min，将上清转移至10 mL Ep管中。取500 μL GST纯化柱（GST agarose），用1 mL蛋白裂解缓冲液重悬GST纯化柱，4℃，100 ×g离心1 min，去除上清，并重复该步骤3次洗去保护液。去除上清后，转移到装有细菌破碎液的10 mL Ep管，4℃旋转孵育8 h。孵育后的液体，4℃，1 000 r/min 离心1 min，去除上清，并将GST纯化柱转移到2 mL Ep管，加入1 mL蛋白漂洗缓冲液（50 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl）重悬，4℃颠倒5 min，以洗去非特异性结合的蛋白，此过程重复3次。离心去上清后加入1 mL蛋白洗脱缓冲液（20 mmol/L Tris pH 7.5，20 mmol/L GSH，150 mmol/L NaCl），4℃洗脱 3 h。取10 μL纯化的蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳考马斯亮蓝染色检测。

1.2.4 EBP1-GST与总RNA结合实验 取8 μL纯化的EBP1-GST蛋白（以GST蛋白作为对照）加到100 μL总蛋白绑定缓冲液（150 mmol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl pH 7.4，0.5 mmol/L EDTA，蛋白酶抑制剂）中，然后在总蛋白绑定缓冲液中分别加入50 μL的GST纯化柱（已用总蛋白绑定缓冲液洗3次），4℃结合3 h后，用总蛋白绑定缓冲液洗3次，每次5 min，洗掉杂蛋白，备用。用TRIzol法提取拟南芥RNA，用36 μL水溶解，吸取2 μL检测是否降解（质量合格的RNA有3条带，从大到小分别是28S、18S、5.8S）。将结合有EBP1-GST、GST蛋白的GST纯化柱以及没有孵育蛋白的GST纯化柱中加入20 μL的RNA和100 μL总蛋白绑定缓冲液（包含8 U/mL RNA酶抑制剂）室温孵育30 min，其余RNA存放于-80℃冰箱，用1 mL总蛋白绑定缓冲液将GST纯化柱洗3次，洗去未结合的RNA，利用TRIzol法提取样品中的RNA，取2 μL -80℃储存的RNA，与其他实验样品一起用琼脂糖凝胶电泳检测RNA含量，同时测定RNA浓度及OD260值［18］。

1.2.5 RIP实验 称取生长7 d的EBP1-GFP植物幼苗3 g，置于50 mL离心管中，用清水洗3次，加入35 mL 0.5%甲醛，立即真空固定5 min（压力为9MPa），释放真空，继续固定8 min，然后加入1.5 mL 2 mol/L甘氨酸，抽真空1 min，释放真空，再抽真空5 min（终止甲醛交联反应），释放真空，清水洗5次，用吸水纸去除水分，液氮速冻。将幼苗在液氮中充分研磨，加入500 μL总蛋白提取液（20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，5 mmol/L EDTA，5 mmol/L EGTA，0.05%SDS，10 mmol/L DTT，1 mmol/L PMSF，1% 蛋白酶抑制剂，8 U/mL RNA酶抑制剂），冰上静置1 h。4℃，12 000 r/min离心10 min，收集上清到新的1.5 mL Ep管，取100 μL植物抽提液作为Input，其余样品分成两份，一份作为对照组，一份作为实验组。取两份40 μL GFP-Tarp，用RIP结合缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl pH 8，150 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA，0.1%SDS，1% TritionX-100）洗3次，去上清，加入300 μL RIP结合缓冲液和1 mL Chip稀释缓冲液（16.7 mmol/L Tris-HCl pH 8，167 mmol/L NaCl，1.2 mmol/L EDTA，1.1% TritionX-100，8 U/mL RNA酶抑制剂，1%蛋白酶抑制剂），再分别加入实验组和对照组的植物抽提液，4℃结合过夜。将结合有蛋白的GFP-Tarp用RIP结合缓冲液洗3次以洗去杂蛋白，去上清后加入50 μL RIP洗脱缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，100 mmol/L EDTA，0.1% SDS，1 U/mL RNA 酶抑制剂），65℃振荡10 min，离心后将上清转移至新的Ep管，再向GFP-Tarp中加入50 μL RIP洗脱缓冲液，65℃振荡10 min，将两次上清合并，在Input以及上清加入1 μL 14 mg/mL蛋白酶K，56℃放置1 h，释放结合的RNA，之后用TRIzol法提取RNA，逆转录获得cDNA，作为进一步qRT-PCR的模板，以上试剂均用DEPC水配制。

1.2.6 RNA-EMSA实验 将100 ng纯化的EBP1-GST蛋白（GST空载蛋白作为对照）和100 pg FITC荧光修饰的RNA探针（不带FITC修饰的RNA竞争探针作为对照）加入RNA-EMSA结合缓冲液（10mmol/L Tris，5%甘油，1 mmol/L MgCl2，50 mmol/L KCl，0.2 mg/mL BSA，0.5 mmol/L DTT，0.5 mg/mL polyglutamate pH 7.5）中，室温放置20 min。用6.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶（6.5%凝胶储液，10%甘油，1%过硫酸铵，TEMED，0.5×TBE）先在冰上预电泳0.5 h，冲洗胶孔，上样，电泳1 h后，用KODAK 4000M Image Station 显影［19］。

1.2.7 虫草素（cordycepin）处理实验 取1/2 MS固体培养基上生长7 d的拟南芥幼苗，浸没于CRD处理缓冲液（1 mmol/L哌嗪-1，4-二乙磺酸，1 mmol/L柠 檬 酸 钠 pH 6.25，1 mmol/L KCl，15 mmol/L 蔗糖，150 μg/mL虫草素）中，抽真空3 min后，继续放置于22℃光照处理15 min、30 min、45 min后，提取RNA并逆转录成cDNA，用于后续qRT-PCR检测［20］。

1.2.8 核糖体提取实验 取生长7 d的拟南芥幼苗1g，用纸吸干，液氮充分研磨后，每个样加入500 μL提取液（0.2 mol/L Tris-HCl pH 7.5，50 mmol/L KCl，25 mmol/L MgCl2，50 μg /mL 放线菌酮，50 μg/mL 虫草素，400 U/mL RNA酶抑制剂，10 μL蛋白酶抑制剂Cocktail，1 mmol/L PMSF）冰上抽提30 min，同时在预冷的50 mL离心管铺制10%-60%梯度的蔗糖，将植物提取液4℃，12 000 r/min离心10 min。取上清轻轻滴加在已铺好的蔗糖上层，同时将没有植物样品各梯度蔗糖作为对照。4℃，32 000 r/min离心4 h。离心后取不同梯度组分，测定各个组分OD260吸光值。提取45%-60%蔗糖梯度组分的RNA，逆转录得到的cDNA用于后续qRT-PCR检测［21］。

1.2.9 RNA提取与qRT-PCR 用TRIzol法提取拟南芥总RNA后，通过逆转录试剂盒逆转录成cDNA，用Bio-rad定 量PCR仪（C1000 TouchTMThermal Cycler）进行qRT-PCR实验。

2 结果

2.1 EBP1蛋白结合RNA的结构域分析

拟南芥EBP1一级结构域预测结果发现，在48-56氨基酸区域存在结合RNA的结构域（图1-A）。同时我们在Phyre2网站预测了其晶体结构，发现人类与拟南芥EBP1于蛋白表面均含有两个封闭的环状结构（Loop）。拟南芥EBP1蛋白48-56氨基酸区域就位于Loop1环结构中，并且此序列与人类EBP1报道的结合RNA的σ70-like motif（46-54氨基酸）序列类似（图1-B），这暗示EBP1在结构上具有结合RNA的潜能。

表1 引物列表

2.2 EBP1在体外直接绑定RNA

为了进一步验证EBP1蛋白是否可以直接结合RNA，我们首先进行了总RNA结合实验（图2），实验结果显示：GST蛋白结合的泳道（第三泳道）与对照组GST纯化柱结合的泳道（第二泳道）RNA条带亮度基本一致，EBP1-GST蛋白结合的RNA条带（第四泳道）与第二泳道相比亮度明显增强（图2-A）。定量分析显示，对照组GST纯化柱、GST蛋白和EBP1-GST蛋白结合的RNA浓度分别是0.041 2 μg/μL、0.044 8 μg/μL、0.132 4 μg/μL（表 2）。以上实验数据表明EBP1-GST蛋白结合RNA的浓度明显高于对照组（P<0.05），而GST蛋白与对照组基本一致（P>0.05），即EBP1-GST可以结合部分RNA，GST蛋白不能结合RNA。

图1 EBP1蛋白结构域分析

进一步表达并纯化了EBP1-GST蛋白（图2-B），然后合成FITC修饰的探针“GUCUCUCACUGCGACGGCUU”（Probes）以及不修饰的探针“GUCUCUCACUGCGACGGCUU”（Competitor），通 过与EBP1-GST、GST蛋白孵育，同时用50倍和100倍的不修饰的特异性探针（Competitor）进行RNAEMSA实验。实验结果表明：对照组GST纯化柱（第一泳道）和GST（第二泳道）蛋白与探针孵育的泳道没有出现迁移的电泳条带，EBP1-GST与探针孵育泳道（第三泳道），显示出明显迁移的电泳条带，且条带的强度随着竞争性探针（Competitor）浓度的升高而减弱（第四、五泳道）。表明GST蛋白不能结合RNA，而EBP1蛋白可以直接绑定“GUCUCUCACUGCGACGGCUU”这一RNA序列（图2-C）。

表2 样品浓度及吸光值

图2 EBP1蛋白与RNA直接相互作用

2.3 在拟南芥体内EBP1绑定RNA

为了进一步验证拟南芥EBP1在体内结合RNA，首先通过NCBI网站Blast找到12个基因含有“GUCUCUCACUGCGACGGCUU”序列（图3-A）：AT1G24792、AT3G24320、AT1G25211、AT1G07150、AT1G11810、AT5G55950、AT3G13830、AT3G14400、AT3G17265、AT3G21120、AT3G63200、AT3G24700，利用实验室已有的EBP1-GFP转基因过表达植株，结合RIP技术，对这12个潜在EBP1靶mRNA进行了RIP-qRT-PCR验证。结果显示：AT1G24792被对照组GFP-Trap免疫沉淀的RNA相对含量是2.623 40，被实验组EBP1-GFP免疫沉淀的RNA相对含量5.094 07；AT3G24320被免疫沉淀的RNA在对照组和实验组的相对含量分别是2.936 38、13.318 90。AT1G25211被免疫沉淀的RNA在对照组和实验组的相对含量分别是3.462 92、9.613 54，这3个基因的mRNA被EBP1-GFP免疫沉淀后相比对照组有显著性差异（AT1G24792，P<0.05；AT3G24320，P<0.001；AT1G25211，P<0.01），其他9个基因被EBP1-GFP免疫沉淀的RNA相比对照没有显著性差异（P>0.05）（图3-B）。表明EBP1结合AT1G24792、AT3G24320、AT1G25211的 RNA， 并可能参与其转录后调控过程。

2.4 EBP1调控靶RNA的稳定性

为了研究EBP1对靶RNA转录后事件的调控，首先我们分析了EBP1对基因AT1G24792、AT3G24320、AT1G25211在RNA稳定性方面的影响。利用虫草素这种转录抑制剂，结合qRT-PCR技术检测靶RNA的降解速度，进而分析RNA的稳定性。于是对Col-0、ebp1-1、ebp1-2、EBP1-GFP植株用虫草素处理后，进行qRT-PCR检测。ATHSPRO2基因是一个已被报道mRNA不稳定的基因，虫草素处理后ATHSPRO2mRNA会迅速降解，证明虫草素处理有效（图 4-A）。Col-0、ebp1-1、ebp1-2、EBP1-GFP植株在虫草素处理0 min时这3个靶基因的mRNA含量均为1。相对于0 min mRNA含量，EBP1突变后AT1G24792mRNA的含量在虫草素处理30 min、45 min分别为0.574 7、0.218，而对照组Col-0中AT1G24792mRNA分别是0.33、0.03，过表达EBP1-GFP AT1G24792mRNA含量在30 min、45 min分别为0.301 58、0.046 03（图4-B）；EBP1突变后AT3G24320mRNA在处理15 min、30 min后含量分别为0.222、0.191 1，对照组Col-0中AT3G24320mRNA在虫草素处理15 min、30 min时的相对含量是0.642 8、0.33，过表达EBP1-GFP AT3G24320mRNA 含量在 15 min、30 min 分别为 0.202 5、0.13（图4-C）；EBP1突变后虫草素处理15 min、45 min后AT1G25211mRNA相对含量分别是0.807 3、0.218 4，Col-0被虫草素处理15 min、45 min后AT1G25211mRNA相对含量分别是0.802 0、0.263 9（图4-D）。以上数据表明：EBP1促进AT1G24792、AT3G24320mRNA的降解，而对AT1G25211mRNA的稳定性没有影响。

图3 EBP1在体内与特定基因的mRNA相互作用

进一步我们通过qRT-PCR手段检测Col-0、ebp1-1、ebp1-2、ebp1-3、EBP1-GFP植物中靶mRNA的含量（图4-E-G）。数据显示AT1G24792mRNA在Col-0、ebp1-1、ebp1-2、ebp1-3、EBP1-GFP的相对含量为1.660 57、4.297 34、5.955 5、1.904 86、0.873 17，即AT1G24792mRNA在ebp1-1、ebp1-2中明显增多（P<0.05），而在过表达中mRNA没有显著改变（P>0.05）（图 4-E）。AT3G24320的 mRNA相对含 量 在 Col-0、ebp1-1、ebp1-2、ebp1-3、EBP1-GFP分 别 为 1.034 72、2.661 91、2.310 78、4.561 03、0.392 15，即EBP1突变后AT3G24320mRNA的含量增加（P<0.05），EBP1过表达AT3G24320mRNA的含量减少（P<0.05）（图4-F）。AT1G25211的mRNA相对含量在Col-0、ebp1-1、ebp1-2、ebp1-3、EBP1-GFP分别为 1、0.567 20、0.426 91、0.659 82、1.466 62，表明EBP1对AT1G25211的mRNA含量没有显著影响（P>0.05）（图 4-G）。

综合RNA稳定性和植物中靶mRNA表达量检测的实验结果，我们发现EBP1突变后AT1G24792、AT3G24320的mRNA稳定性增强，从而使这些基因的mRNA含量增加，即EBP1可以调控靶RNA的稳定性。

2.5 EBP1调节靶mRNA的翻译速率

为了探究在拟南芥中EBP1是否对核糖体的成熟、mRNA的翻译速率起调节作用，本实验通过蔗糖密度梯度离心分离核糖体来检测EBP1对3个靶基因mRNA翻译速率的影响。数据显示：AT1G24792在ebp1-1的多聚核糖体组分（8-11）中mRNA的相对含量分别是1.53、0.95、1.71、1.02，在Col-0植物的多聚核糖体组分（8-11）中相对含量是0.94、0.43、1、0.91（图5-B）；AT3G24320在ebp1-1的多聚核糖体组分（8-11）中mRNA的相对含量分别是2.31、4.69、4.39、2.62，在Col-0植物的多聚核糖体组分（8-11）中相对含量是0.95、2.34、2.65、1.38（图5-C）；AT1G25211在ebp1-1的多聚核糖体组分（8-11）中mRNA的相对含量分别是0.76、0.75、1.15、1.05，在Col-0植物的多聚核糖体组分（8-11）中mRNA的相对含量是1.28、1.91、1.51、1.39（图5-D）；以上数据表明EBP1突变与对照Col-0比可以促进多聚核糖体组分中AT1G24792、AT3G24320mRNA增多（P<0.05），而多聚核糖体结合AT1G25211的mRNA明 显 减 少（P<0.05）， 即 EBP1抑 制AT1G24792、AT3G24320的mRNA与核糖体的结合，促进AT1G25211mRNA与核糖体的结合。因此植物中EBP1也可以调控mRNA的翻译过程。

3 讨论

RBPs通过与RNA相互作用在转录后调控过程中发挥重要作用，从而调节细胞功能。植物拥有复杂的RBPs系统，参与调节植物生长的多个过程，包括调控开花时间［22］、激素反应［23］、生物钟［24］、生物［25］及非生物胁迫［26］等过程。研究RBPs的生物学功能并解析其调控的分子机制将有助于挖掘新的功能基因，为农作物改良提供新的种质资源。

RNA与蛋白质的相互作用通常是通过一个特异的RNA识别基序实现的，Foley等［27］利用蛋白质测序技术对拟南芥有根毛和无根毛细胞核中的RBPs进行测序，结果发现“GUCUCUCACUGCGACGGCUU”可能是EBP1潜在的靶RNA序列。本研究发现拟南芥EBP1蛋白可以直接绑定“GUCUCUCACUGCGACGGCUU”RNA序列，并且找到了EBP1的3个靶基因RNA（AT1G24792、AT3G24320、AT1G-25211），进一步研究发现EBP1可以调控AT1G24792和AT3G24320的mRNA稳定性，对AT1G25211的mRNA稳定性没有明显影响。在此过程中EBP1如何实现对靶RNA的特异性识别与结合，是否还有更多的靶RNA没有被发现，今后可综合RIP-seq等技术，筛选更多与EBP1相互作用的RNA。另外，RNA结合蛋白通过识别位于mRNA 3'UTR富含AU的区域途径或者识别含有提前终止密码子的mRNA的 NMD（Nonsense-mediated mRNA decay） 等 途 径来影响靶RNA的稳定性［28］。然而EBP1是如何调控AT1G24792和AT3G24320的mRNA稳定性的目前还不清楚，还需要进一步实验研究。

图5 EBP1调节靶mRNA的翻译效率

EBP1在动植物中是受体酪氨酸激酶ErbB3磷酸化调控的核质穿梭蛋白［29-30］。哺乳动物中，ErbB3是 HRG/NRG（Heregulin/neuregulin）小肽的受体［31］。在乳腺癌细胞中，当HRG 配体小肽结合ErbB3受体时，ErbB3与EBP1相互作用，使EBP1磷酸化并促使其在细胞核积累，发挥抑制细胞生长，促进细胞分化的功能［32］。植物中EBP1作为核质穿梭的转录因子，其功能已有研究。CrRLK1L（Catbarantbus roseusRLK1-like）成员FERONIA感知RALF1（Rapid Alkalinization Factor 1）小肽信号后，FERONIA与EBP1相互作用，使EBP1磷酸化并在细胞核积累，EBP1入核后抑制CML38的转录［16］。EBP1磷酸化状态的改变是否影响其对转录后事件的调控仍不清楚。EBP1对RNA稳定性、mRNA翻译的调控过程是否受到上游磷酸化蛋白调控也需要进一步研究。报道显示拟南EBP1与核糖体的结合分布于细胞质、细胞核及核仁之间，且EBP1可以结合不同种类的RNA［17］，EBP1蛋白在调控植物器官大小、逆境胁迫等多个方面发挥功能［16］，那么，EBP1在不同的位置结合核糖体所行使的功能有何差异，其是否是通过改变蛋白构象或结合特定的基序来识别不同的RNA，从而实现不同的功能？所以，结合遗传学多层次探究EBP1在RNA水平调控的生物学意义，是今后需要关注和研究的重点。

4 结论

本研究通过运用生物信息学分析结合分子生物学手段，发现拟南芥EBP1作为一个RNA结合蛋白，在RNA转录后水平调控过程中发挥功能。EBP1可以直接绑定“GUCUCUCACUGCGACGGCUU”RNA基序；生物信息学分析结合RIP-qRT-PCR技术，发现了EBP1的3个靶基因RNA（AT1G24792、AT3G24320、AT1G25211）；进一步通过虫草素处理发现拟南芥EBP1促进AT1G24792、AT3G24320mRNA的降解，而对AT1G25211mRNA的稳定性没有影响。核糖体提取实验发现，EBP1抑制AT1G24792、AT3G24320与核糖体的结合，而促进AT1G25211与核糖体结合。因此，EBP1在拟南芥中可以与RNA相互作用，并具有调控靶RNA的稳定性和翻译速率的生物学功能。