不稳定性心绞痛患者的血清蛋白质组学研究

不稳定性心绞痛是由于冠状动脉不稳定性斑块的破裂伴发血栓形成引起的急性心血管事件，不稳定斑块的破裂是其发生、发展的病理生理基础。如何筛选出与不稳定性心绞痛相关的特异性生物标志物，敏感性更高、特异性更强，是心血管专业所面临的重大课题[1-2]。近年来蛋白质组学技术的飞速发展，为其提供了新的思路和技术平台[3]。蛋白质组学是指一个生物体/组织/细胞所表达的整套蛋白质，是研究特定组织在不同时空情况下全部蛋白质表达和功能的技术，有助于寻找疾病诊治的新标志物。血清标本的取材相对简便，容易获取，是较为理想的临床样本[4-7]，本研究以不稳定性心绞痛患者的血清为研究对象，希望能找出与之相关的特异蛋白质。

1 对象与方法

1.1 对象入选2018年1—11月在空军特色医学中心就诊的患者，共200例，临床怀疑冠心病（主要表现为异常心电图、胸痛不适和/或心肌核素检查异常），年龄45～75岁，所有患者行冠状动脉造影检查，依据冠状动脉造影结果分为2组：造影阴性为正常对照组，冠状动脉有不同程度狭窄为不稳定性心绞痛组，各100例。本研究获得空军特色医学中心医学伦理委员会批准，并向患者及其家属签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器ProteoExtract-Albumin/IgC Removal Kit购自德国Merck公司，Immobilized pH gradient IPG 4-7（17 cm）、immobilized pH gradient IPG 3-10（17 cm）购自美国Bio-Rad公司，Human SAA ELISA试剂盒、Human Gelsolin ELISA试剂盒购自美国Invitrogen公司，YM-3超滤膜购自美国Millipore公司，IPGphor等电聚焦仪购自美国GE公司，Ettan DALT Ⅵ垂直平板电泳系统、Typhoon 9410扫描仪购自美国Amersham Biosciences公司，ABI 4800 MALDI-TOF-MS质谱仪购自美国Applied Biosystcm公司。

1.3 方法应用双向荧光差异凝胶电泳（2DEDIGE）和质谱分析技术，对不稳定性心绞痛及冠状动脉正常人群各100例，行血清蛋白质组学研究，并选取2个具有代表性的差异蛋白应用ELISA进行验证。血清标本的收集和处理纯化、ELISA检测急性期反应蛋白血清淀粉样蛋白A2（SAA2）、凝溶胶蛋白（Gelsolin）的浓度均按照相关说明书操作。差异凝胶双向电泳和质谱分析在蛋白质组学研究中心进行。

1.4 统计学处理应用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析，计量变量以±s表示，采用方差分析，计数资料以率（%）表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料比较2组患者在年龄、血压、血糖、白细胞计数，是否合并糖尿病、高脂血症，吸烟与否、阿司匹林、血管紧张素转化酶抑制剂/血管紧张素Ⅱ受体拮抗药（ACEI/ARB）类药物、β受体-阻断药应用比例等各方面比较差异无统计学意义；不稳定性心绞痛组的男性患者比对照组多，高敏C反应蛋白（high sensitive c-reactive protein，hs-CRP）水平及服用他汀类药物比例明显高于对照组，总胆固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平低于对照组（表1）。

表1 2组怀疑冠心病患者的一般资料

图1 不稳定性心绞痛组和对照组的差异表达蛋白谱的荧光重叠图

2.2 差异蛋白质点的质谱分析用SDS-PAGE电泳图比较原血浆和去除IgG和ALB的血浆，经过处理的样品已除去高丰度蛋白。2-DE凝胶分别经过3个通道扫描（图1），分析软件为DeCyder6.5，对匹配蛋白质点的丰度进行差异比较，得到了32个差异有统计学意义（P＜0.05）蛋白质点，其中有19个点下调，13个点上调。利用制备胶分离蛋白样品，经MALDI-TOF/TOF质谱分析，共鉴定到11种19个差异蛋白（表2），存在着翻译后修饰的情况。SAA2、铜篮蛋白、α-1抗胰蛋白酶α-AT以及结合珠蛋白、补体系统的C4和C6前体发生上调。有载脂蛋白A-Ⅰ，ApoA-Ⅰ，ApoA-Ⅳ及其前体，转铁蛋白11 kD、7 kD，转甲状腺素蛋白，细胞骨架的凝溶胶蛋白、凝溶胶蛋白-1亚基、Myosin-11，血红蛋白β链和11 kDa亚基下调（表2）。

表2 差异蛋白质的质谱鉴定结果

2.3 差异表达蛋白质的功能分析对鉴定的蛋白质进行分析显示，差异蛋白质涉及到急性期反应、炎症反应、细胞骨架、脂代谢和能量代谢等多种功能，其中急性期反应蛋白占28.1%、脂代谢蛋白占12.5%、补体系统蛋白占12.5%、细胞骨架蛋白占12.5%、能量代谢相关蛋白占16.7%、纤维蛋白占8.3%，其他功能未知蛋白占8.3%。

2.4 ELISA验证双向凝胶电泳的定量结果为验证双向凝胶电泳结果的可靠性，选取2个具有代表性的差异蛋白，急性期反应蛋白-血清淀粉样蛋白A2（SAA2）和细胞骨架蛋白-凝溶胶蛋白（Gelsolin），并选取年龄和性别匹配的冠脉正常人（对照组）、稳定性心绞痛（稳定型心绞痛组）、不稳定性心绞痛（不稳定性心绞痛组）以及急性心肌梗死（急性心肌梗死组）患者各50例，应用ELISA进行。结果显示，SAA2在冠状动脉正常组和稳定心绞痛组患者中表达水平差异无统计学意义，不稳定性心绞痛组和急性心肌梗死组患者明显高于对照组和稳定性心绞痛组（P＜0.01），其中急性心肌梗死组最高（图2）。Gelsolin在对照组、稳定性心绞痛组、不稳定性心绞痛组和急性心肌梗死组中的表达水平逐渐减低，急性心肌梗死组最低（图3）。

图2 SAA2在血清中的表达

图3 Gelsolin在血清中的表达

3 讨论

本研究以不稳定性心绞痛患者的血清为研究对象，采用2DE-DIGE-MS方法分析差异蛋白质点，并应用ELISA进行验证，结果发现11种19个差异蛋白质点，涉及到急性期反应、炎症反应、细胞骨架、脂代谢和能量代谢等。

3.1 急性期反应蛋白SAA2、铜篮蛋白、α-1抗胰蛋白酶在不稳定性心绞痛中上调。SAA2属于急性期蛋白，在机体遭受创伤、手术、感染、烧伤等应激时明显升高，是反映体内炎症的敏感指标。本研究结果显示，急性冠状动脉综合征（ACS）时机体伴有明显的急性期反应，SAA2上调，和既往文献报道相一致[8]。铜篮蛋白是人体重要的亚铁氧化酶，对铁的转运和平衡起着重要作用。研究证实，铜蓝蛋白能够促进体内氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的形成，在动脉硬化进展中起到一定的作用[9]。本研究结果显示，不稳定性心绞痛患者铜篮蛋白升高，说明与其进展有关。α-AT是主要炎性反应蛋白之一，属于蛋白酶抑制因子，在缺血再灌注损伤的急性期表达增高，已有多个研究报道α-AT和ACS密切相关[9]。

3.2 补体系统的C4和C6前体表达上调补体系统是由血清/组织液中的一组可溶性蛋白及存在于血细胞表面的膜结合蛋白和补体受体所组成，大量事实证明补体系统与动脉粥样硬化的病理过程相关，可引起血小板聚集，脂质及组织氧化过程[10]。在本研究中，C4B和C6前体表达上调，说明炎症反应可能参与了ACS的发生发展。

3.3 纤维蛋白升高纤维蛋白是体内重要的凝血因子，血浆纤维蛋白水平升高与动脉粥样硬化严重程度密切相关，是冠心病的一个独立危险因素，纤维蛋白升高提示机体凝血相关蛋白异常，易致血栓形成，促进不稳定性心绞痛的发生发展。

3.4 ApoA-Ⅰ、ApoA-Ⅳ及其前体表达下调ApoA-Ⅰ是高密度脂蛋白的主要蛋白成分，ApoA-Ⅰ降低是心肌梗死的独立危险因素。ApoA-Ⅳ是一种脂结合蛋白，主要作用是参与脂质代谢，ApoA-Ⅳ通过介导HDL与肝细胞的结合以及被摄取，参与了胆固醇逆向转运，具有抗动脉粥样硬化作用[11]。本研究中不稳定性心绞痛患者载脂蛋白均下调，说明脂代谢紊乱在其发病中起到重要的作用。

3.5 转铁蛋白11 kD、7 kD下调转铁蛋白是由肝脏合成的一类结合球蛋白，主要生理作用是维持体内金属离子稳态，抑制LDL氧化修饰，从而减轻动脉硬化发生发展[12]。本研究中转铁蛋白下调，说明转铁蛋白在ACS发病中可能起到一定的作用。

3.6 转甲状腺素蛋白下调转铁蛋白是一种急性期负相蛋白，在机体内起运输营养物质、激素和代谢物等作用，本研究中转甲状腺素蛋白下调，说明ACS发生时可能伴有代谢失常。

3.7 组成细胞骨架Gelsolin、凝溶胶蛋白-1亚基下调凝溶胶蛋白是组成细胞骨架蛋白的重要成分之一，属于肌动蛋白结合蛋白，其主要功能是切割肌动蛋白（actin），介导细胞外骨架重排，和粥样斑块的纤维帽厚薄有关。本研究显示ACS患者Gelsolin下调，运用ELISA的方法进一步验证，说明急性冠脉综合征时凝溶胶蛋白下调，纤维帽变薄，进一步促进其发生发展。

综上所述，本实验采用血清蛋白质组学技术分析了不稳定性心绞痛发生发展过程中蛋白质表达谱的变化，通过对差异蛋白的生物学功能分析，发现急性期反应蛋白、补体系统及凝血相关蛋白的异常，载脂蛋白、细胞骨架蛋白的降低，能量代谢紊乱等一系列的病理生理改变参与不稳定性心绞痛的进展。发现了某些特异表达蛋白质的改变，特别是细胞骨架蛋白，如凝溶胶蛋白的改变，尚未见相关报道，可能为心绞痛的防治提供新靶点，虽然进行了小样本量的ELISA验证，但尚需进一步实验研究和大规模临床验证。