UPLC-Q-Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨率质谱法同时测定参芪健胃颗粒中8个成分的含量

吴丹　刘斌　邹瑜

中图分类号 R285.2 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2020）05-0600-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.05.19

摘 要 目的：建立同时测定参芪健胃颗粒中绿原酸、芍药苷、橙皮苷、甘草酸铵、柠檬苦素、川陈皮素、橘皮素、党参炔苷含量的方法。方法：采用超高效液相色谱（UPLC）-Q-Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨率质谱法。色谱柱为Hypersil Gold C18，流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液（梯度洗脱），流速为0.4 mL/min，柱温为35 ℃，进样量为1 μL;采用加热型电喷雾离子源，以正离子检测模式，在质荷比100～1 000 范围内进行高分辨率全扫描。通過提取目标化合物的精确质量数进行定量，测定2个厂家共3批样品中8个成分的含量。结果：绿原酸、芍药苷、橙皮苷、甘草酸铵、柠檬苦素、川陈皮素、橘皮素、党参炔苷8个成分的检测质量浓度线性范围分别为0.12～1.46、3.51～42.15、2.71～32.55、1.76～21.10、0.04～0.46、0.04～0.24、0.02～0.21、0.01～0.25 μg/mL（r≥0.999 0）;定量限分别为6.06、0.04、0.03、0.02、7.60、0.05、0.02、6.25 ng/mL;检测限分别为3.03、0.01、0.01、0.01、3.80、0.01、0.01、2.50 ng/mL;精密度、重复性及稳定性（24 h）试验的RSD均小于5%（n=6）;平均加样回收率为93.16%～97.78%（RSD≤5%，n=6）;3批样品中8个成分的含量分别为12.62～13.20、265.01～472.26、234.20～278.90、173.10～255.74、2.32～2.83、2.37～3.58、0.79～1.22、0.91～1.78 μg/g。结论：本方法简便、快速、准确且重复性好、灵敏度高，可为参芪健胃颗粒的质量控制提供依据。

关键词 超高效液相色谱-Q-Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨率质谱法;参芪健胃颗粒;含量测定

Simultaneous Determination of 8 Components Contents in Shenqi Jianwei Granules by UPLC-Q-Exactive Quadrupole Electrostatic Field Orbital Hydrazine High Resolution Mass Spectrometry

WU Dan1，2，LIU Bin3，ZOU Yu1（1.Hubei Province Key Laboratory of Occupational Hazard Identification and Control， School of Medicine， Wuhan University of Science and Technology， Wuhan 430065， China;2.School of Pharmacy， Guangzhou Medical University， Guangzhou 511436， China;3.Tianjin Best Peptide Pharmaceutical Technology Co.， Ltd.， Tianjin 300354， China）

ABSTRACT   OBJECTIVE： To develop a method for simultaneous determination of chlorogenic acid， paeoniflorin， hesperidin， ammonium glycyrrhizate， limonin， nobiletin， tangeretin and lobetyolin in Shenqi jianwei granules. METHODS： UPLC-Q-Exactive quadrupole electrostatic field orbital hydrazine high resolution mass spectrometry method was adopted. The determination was performed on Hypersil Gold C18 column with a mobile phase consisted of acetonile-0.1% formic acid （gradient elution） at the flow rate of 0.4 mL/min. The column temperature was set at 35 ℃， the sample size was 1 μL. High resolution full scan experiments was performed over the range of m/z 100-1 000 in heating electro-spray lonization and positive mode to extract the accurate mass of analytes. The contents of 8 components were determined in 3 batches of samples from 2 manufacturers. RESULTS： The linear range of chlorogenic acid， paeoniflorin， hesperidin， ammonium glycyrrhizate， limonin， nobiletin， tangeretin and lobetyolin were 0.12-1.46， 3.51-42.15， 2.71-32.55， 1.76-21.10， 0.04-0.46， 0.04-0.24， 0.02-0.21 and 0.01-0.25 μg/mL， respectively （all r≥0.999 0）. The limits of quantitation were 6.06， 0.04， 0.03， 0.02， 7.60， 0.05， 0.02， 6.25 ng/mL， respectively. The limits of detection were 3.03， 0.01， 0.01， 0.01， 3.80， 0.01， 0.01， 2.50 ng/mL， respectively. RSDs of precision， reproducibility and stability （24 h） tests were all lower than 5% （n=6）. Average recoveries were 93.16%-97.78% （RSD≤5%，n=6）. The contents of 8 components in 3 batches of samples were 12.62-13.20， 265.01-472.26， 234.20-278.90， 173.10-255.74， 2.32-2.83， 2.37-3.58， 0.79-1.22， 0.91-1.78   μg/g， respectively. CONCLUSIONS： The established method is simple， convenient， rapid， accurate， highly reproducible and sensitive， which can be used for quality control of Shenqi jianwei granules.

2.4.2 线性关系及定量限、检测限考察 取“2.3.1”项下混合对照品溶液，用甲醇逐级稀释，得系列混合对照品溶液，其中各待测成分质量浓度分别为绿原酸1.46、0.73、0.36、0.29、0.24、0.18、0.12 μg/mL，芍药苷42.15、21.08、10.54、8.43、7.02、5.27、3.51 μg/mL，橙皮苷32.55、16.28、6.51、5.43、4.01、3.62、2.71 μg/mL，甘草酸铵21.10、10.55、5.28、4.22、3.52、2.64、1.76 μg/mL，柠檬苦素0.46、0.23、0.11、0.09、0.08、0.06、0.04 μg/mL，川陈皮素0.24、0.12、0.10、0.08、0.06、0.05、0.04 μg/mL，橘皮素0.214、0.071、0.043、0.036、0.026、0.024、0.018 μg/mL，党参炔苷0.250、0.200、0.100、0.063、0.050、0.025、0.013 μg/mL。分别取各对照品溶液，按“2.1”“2.2”项下条件进样测定，记录峰面积。以待测成分的质量浓度为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y）绘制标准曲线，并计算成分的回归方程。结果，8个待测成分在检测质量浓度范围内线性关系良好，r均大于0.999 0。选取信噪比为10时各待测成分质量浓度作为定量限，信噪比为3时各待测成分质量浓度作为检测限。8个待测成分的线性关系及定量限、检测限结果见表2。

2.4.3 加样回收率考察 取同一批次样品（批号：20180434）1 g，精密称定，平行称取6份，分别精密加入与样品中绿原酸、芍药苷、橙皮苷、甘草酸铵、柠檬苦素、川陈皮素、橘皮素、党参炔苷质量相当的对照品溶液，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”“2.2”项下条件进样检测，记录峰面积，并计算加样回收率，结果见表3。

2.4.4 精密度考察 取“2.3.1”项下同一混合对照品溶液，按“2.1”“2.2”项下条件连续进样6次，记录各待测成分的峰面积。结果，绿原酸、芍药苷、橙皮苷、甘草酸铵、柠檬苦素、川陈皮素、橘皮素、党参炔苷峰面积的RSD分别为2.26%、1.94%、2.08%、1.92%、2.95%、2.00%、1.40%、1.34%（n=6），均符合精密度试验的要求。

2.4.5 重复性考察 取同一批次样品（批号：20180434），共6份，按“2.3.2”项下方法平行制备供试品溶液，按“2.1”“2.2”项下条件进样测定，记录各待测成分峰面积，并按标准曲线计算其含量。结果，绿原酸、芍药苷、橙皮苷、甘草酸铵、柠檬苦素、川陈皮素、橘皮素、党参炔苷含量的RSD分别为1.51%、3.36%、2.63%、2.56%、4.01%、3.44%、3.91%、4.01%（n=6），表明該方法重复性良好。

2.4.6 稳定性考察 取同一供试品（批号：20180434）溶液，分别于室温下放置0、2、4、6、8、12、24 h时按“2.1”“2.2”项下条件进样测定，记录各待测成分峰面积。结果，绿原酸、芍药苷、橙皮苷、甘草酸铵、柠檬苦素、川陈皮素、橘皮素、党参炔苷峰面积的RSD分别为1.22%、0.91%、2.11%、3.77%、4.09%、2.44%、3.43%、2.26%（n=6），表明供试品溶液在室温条件下放置24 h内稳定性良好。

2.5 样品含量测定

目前，临床上使用的参芪健胃颗粒主要来自2个厂家（即河南辅仁堂制药有限公司和江苏中兴药业有限公司），本文选取2个厂家共3批次的样品进行检测。精密称取3批参芪健胃颗粒样品适量，按“2.3.2”项下制备供试品溶液，按“2.1”“2.2”项下条件进样测定，记录峰面积，按标准曲线计算各成分含量，平行3份，取平均值，结果见表4。

表4 参芪健胃颗粒中8个成分的含量结果（n=3，μg/g）

3 讨论

3.1 分析方法的选择

由于本文中检测的部分成分（如川陈皮素、橘皮素）的含量较低，采用一般的HPLC法测定时因灵敏度有限，不能同时检出;此外，含量较低的成分虽然可通过浓缩后再采用HPLC方法检测，但增加了浓缩的步骤，使操作变得更繁琐。本研究选用的UPLC-Q-Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱法具有检测限低、灵敏度高等优势，样品提取后无需经过浓缩等处理，样品处理过程更简便。

3.2 色谱条件的优化

为提高电离效率，同时避免出现峰拖尾现象，本研究采用0.1%甲酸水溶液作为流动相。为提高8个成分的分离度，缩短分析时间，本研究尝试采用不同的流动相组合来实现8个成分的完全分离。结果表明，采用乙腈-0.1%甲酸水溶液体系进行梯度洗脱，分析时间短（8个成分的保留时间均在10 min之内），分离效果好，方法专属性强。

3.3 扫描方式及定量离子的选择

本文采用的质谱仪可进行全扫描，除可提供定性信息外，还可选取特征母离子作为定量离子，简化了质谱参数的优化，提高了工作效率。故本研究在正离子检测模式下，采用全扫描方式，在m/z 100～1 000范围内检测对照品后，选择响应信号强的特征母离子作为定量离子，并与理论质量数进行比较，结果定量母离子与理论质量数偏差均在1.5 ppm之内。

3.4 提取方法的选择

本研究采用70%甲醇作为提取溶剂，同时考察了超声提取和加热回流提取对提取率的影响。结果2种提取方式所得各成分的提取率相差不大。为简化试验操作，最终采用超声提取的方式。

4 结语

本研究建立了UPLC-Q-Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱法对参芪健胃颗粒中8个成分进行含量测定。结果显示，不同厂家的样品之间，8个成分的含量有一定的差异，可能与原药材的来源或者生产过程有关。因该制剂现有标准中仅有性状、鉴别和检查项，无含量检测项，故本文研究结果可补充完善已有质量标准。综上，本文建立的方法分析时间短、灵敏度高，可为参芪健胃颗粒的质量控制提供技术支持。

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（收稿日期：2019-09-03 修回日期：2019-10-21）

（编辑：刘 萍）