金荞麦中优效组分的网络药理学研究

颜学玲　时政　张云

中圖分类号 R285 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2020）05-0558-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.05.11

摘 要 目的：研究金荞麦中优效组分的药理作用及可能的分子机制。方法：基于网络药理学，以类药性（DL）>0.18和生物利用度（OB）>30%为标准，借助中药整合药理学计算平台（TCMSP）筛选金荞麦中的优效组分;利用药效基团匹配与潜在识别靶标数据库（PharmMapper）获取金荞麦优效组分的潜在作用靶点;利用生物学信息注释数据库（DAVID）对获得的靶点蛋白进行京都基因与基因组数据库（KEGG）信号通路分析和基因本体（GO）生物过程（包括生物过程、分子功能及细胞组分）富集分析（均以P<0.05为标准）。结果：从金荞麦中共筛选出15种优效组分[如槲皮素、木犀草素、原矢车菊素B1、（+）儿茶素、β-谷甾醇等]和114个潜在作用靶蛋白[如雌二醇17-β-脱氢酶1、环腺苷酸（cAMP）特异性3，5-环磷酸二酯酶4D、维生素D3受体、尿苷胞苷激酶2、HRAS基因编码的三磷酸尿苷酶等];涉及34条重要通路，如丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、血管内皮生长因子（VEGF）信号通路、趋化因子信号通路和胰岛素信号通路，其中与癌症相关的通路11条，与代谢相关的通路7条，与内分泌系统相关的通路4条;涉及的分子功能有类固醇激素受体活性、配体依赖的核受体活性、蛋白激酶活性等，细胞组分有细胞液、细胞碎片、可溶性部分等，生物过程有细胞凋亡的调节、有机物反应的过程、内源性刺激反应的过程等。结论：金荞麦可能通过MAPK信号通路、VEGF信号通路、趋化因子通路、胰岛素信号通路等发挥抗肿瘤、抗炎及调节糖脂代谢的作用。

关键词 金荞麦;优效组分;网络药理学;靶点蛋白;信号通路;分子机制

Study on Network Pharmacology of Superior Components of Fagopyrum dibotrys

YAN Xueling，SHI Zheng，ZHANG Yun（Sichuan Industrial Institute of Antibiotics & College of Medicine & Key Laboratory of Coarse Cereal Processing of Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Chengdu University， Chengdu 610106， China）

ABSTRACT   OBJECTIVE： To study the pharmacological effects and possible molecular mechanism of the superior components in Fagopyrum dibotrys. METHODS： Based on network pharmacology， by selecting DL>0.18 and OB>30% as criteria， superior components of F. dibotrys were screened out， using the traditional Chinese medicine integrated pharmacology（TCMIP） platform. Pharm Mapper database was utilized to obtain the potential targets of each components; Kyoto gene and genome database （KEGG） signal pathway analysis and gene ontology （GO） bioprocess enrichment analysis were performed for target protein with DAVID database （all using P<0.05 as criteria）. RESULTS： 15 kinds of superior components [such as quercetin， luteolin， procyanidin B1， （+） catechin and β-sitosterol， etc.] and 114 target proteins （such as estradiol 17-β-dehydrogenase 1， cAMP specific 3，5-cyclic phosphodiesterase 4D， vitamin D3 receptor， uridine cytidine kinase 2， urokinase triphosphate encoded by HRAS gene， etc.） were screened out， involving 34 important pathways， like MAPK signaling pathway， VEGF signaling pathway， chemokine signaling pathway and insulin signaling pathway; among them， 11 were cancer-related pathways， 7 were metabolic-related pathways， 4 were endocrine-related pathways. The involved molecular functions included steroid receptor activity， ligand dependent nuclear receptor activity， protein kinase activity， etc.; cell components included cell fluid， cell fragment， soluble part， etc.; biological processes included the regulation of apoptosis， the process of organic response， the process of endogenous stimulation response， etc. CONCLUSIONS： F. dibotrys may play anti-tumor effects， anti-inflammatory effects， regulation of glycolipid metabolism by acting on MAPK signaling pathway， VEGF signaling pathway， chemokine signaling pathway and insulin signaling pathway.

KEYWORDS   Fagopyrum dibotrys; Superior components; Network pharmacology; Target proteins; Signaling pathways; Molecular mechanism

金荞麦[Fagopyrum dibotrys（D. Don）Hara]为廖科荞麦属多年生的宿根性植物，主要分布在我国云南、贵州、四川等地[1]。其根茎为常用中药材，又名苦荞麦、金锁开银、荞麦三七等，性凉，味微辛，归肺经，具有清热解毒、排脓祛瘀等功效[2]。现代研究表明，其根茎提取物具有显著的抗肿瘤、降血压、抗菌、消炎等药理作用[3]。金荞麦中所含的化学成分繁多，包括黄酮类、鞣质类、甾体类和萜类化合物等[4]。近年来，金荞麦已成功提取出活性成分并且以此研制出了治疗肺癌的国家中药二类新药威麦宁[5]。

中药的化学成分丰富，药理作用复杂，仅对中药中单个成分的单一靶点的研究模式并不能阐述中药防治疾病的物质基础及作用机制[6]。网络药理学（Network pharmacology）是基于系统生物学和药理学的理论，利用计算机方法来分析整合大量生物学信息进而对疾病的作用机制进行阐述。网络药理学的“多基因、多靶点、多环节”特点，与中药的“多成分、多靶点、多环节”特点相契合[7-8]。通过“疾病表型-基因-靶点-药物”的研究模式，从网络获取数据进行分析，进行新药研发和作用机制的研究，在一定程度上弥补了中药有效成分多、药理作用复杂导致的作用靶点不够明确的缺点。故本文拟采用网络药理学研究技术，分析金荞麦中活性较好并有效用价值的组分（即优效组分）[9]的靶点蛋白及相应的信号通路，为后续研究金荞麦中各组分的作用机制奠定基础。

1 资料和方法

1.1 数据库与软件

中药整合药理学计算平台（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）;有机小分子生物活性库（PubChem，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）;药效团匹配与潜在识别靶标数据库（PharmMapper，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）;生物学信息注释库（DAVID，https：//david.ncifcrf.gov/）;通用蛋白数据库（Uniprot，https：//www.uniprot.org/）。

1.2 金荞麦中优效组分的收集

利用TCMSP数据库，以类药性（DL）>0.18和口服生物利用度（OB）>30%两个标准筛选出金荞麦的优效组分。其中，DL是指化合物中包含的某些特定的功能基团与已知药效基团的相似性，OB则表示药物被吸收后到达血液中的程度与速度，两者均是筛选中药成分时的重要的药动学参数[8]。在TCMSP数据库中得到优效组分的PubChem ID后利用PubChem数据库得到其相对分子质量、三维化学结构等信息，下载其3D化学结构式，保存为MDLSDfile（.sdf）文件格式，备用。若化合物在TCMSP中无对应的PubChem ID，则采用ChemDraw 18.0软件绘制其结构式，并保存为MDLSDfile（.sdf）文件格式，备用。

1.3 金荞麦中优效组分的潜在作用靶点预测

将上述格式为.sdf的文件导入PhamMapper数据库，预测其潜在的作用靶点。将选择靶点集（Select targetset）设置为“仅人类蛋白质靶点”[Human protein targets only（v2010，2241）]，其余參数设置不变。下载结果，得到靶点蛋白、靶点名称、匹配值等信息。其中匹配值为分子和靶点的匹配度，取匹配值排名前20位的靶点蛋白为重要靶标蛋白用于后续研究。由于其在PharMapper数据库中靶点蛋白不够规范，故将其输入Uniprot数据库进行更正，得到其Uniprot ID和相应的基因名称。

1.4 KEGG通路注释分析和GO生物富集

采用DAVID数据库中的功能注释工具对获得的靶点基因进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析，以P<0.05为标准确定重要通路，并对通路进行分类和注释。然后对基因本体（GO）生物过程进行富集分析，以P<0.05为标准确定重要生物过程，并分别取分子功能（MF）及细胞组分（CC）、生物过程（BP）排名前10位的结果导入Origin 2018软件中，绘制GO注释图。

1.5 构建金荞麦优效组分-靶点蛋白-信号通路网络图

将筛选出的金荞麦优效组分与靶点蛋白的对应关系，靶点蛋白与KEGG信号通路的关系结果均导入Cytoscape 3.5.1软件，采用Merge工具构建出金荞麦优效组分-靶点蛋白-信号通路网络图;采用Network Analysis工具对网络图进行拓扑性质分析，筛选出连接度（Degree）排名前10位的靶点蛋白和信号通路进行分析。

2 结果

2.1 金荞麦中优效组分的筛选结果

根据DL>0.18、OB>30%的标准，在TCMSP数据库中共筛选出15种金荞麦优效组分，如槲皮素、木犀草素、原矢车菊素B1、儿茶素、β-谷甾醇等。金荞麦中15种优效组分的基本信息见表1。

2.2 金荞麦中优效组分的潜在作用靶点预测结果

将15种优效组分导入PharmMapper数据库后各取前20位潜在靶蛋白的信息，共得300个靶点蛋白。经手动处理整理、去除重复的靶点蛋白信息后，共得到114个潜在的靶蛋白，如雌二醇17-β-脱氢酶1、环腺苷酸（cAMP）特异性3，5-环磷酸二酯酶4D、维生素D3受体、尿苷胞苷激酶2、HRAS基因编码的三磷酸尿苷（GTP）酶、性激素结合球蛋白、血管内皮生长因子受体2、细胞分裂蛋白激酶2靶点等。金荞麦中优效组分的潜在作用靶点（部分）见表2。

2.3 KEGG通路分析结果

运用DAVID数据库分析得到金荞麦中15种优效组分的114个潜在靶蛋白所涉及的KEGG通路，进而获得重要通路34条（P<0.05）。其中，与癌症相关的通路有11条（如前列腺癌通路、黑素瘤通路、非小细胞肺癌通路），与代谢相关的通路有7条（如药物代谢通路、谷胱甘肽代谢调节通路），与内分泌系统相关的通路有4条，与免疫系统相关的通路有4条，与信号转导相关的通路有3条，与细胞进程相关的通路有2条，与神经系统、排泄系统和细菌传染病相关的通路各有1条。金荞麦中优效组分的重要KEGG通路见表3。

表2 金荞麦中优效组分的潜在作用靶点（部分）

2.4 GO生物过程的富集分析结果

采用DAVID数据库进行GO生物过程的富集分析，共得到286条富集分析结果。其中，在MF中主要涉及类固醇激素受体活性、配体依赖的核受体活性、蛋白激酶活性等;在CC中主要涉及细胞液、细胞碎片、可溶性部分等;在BP中主要涉及细胞凋亡的调节、有机物反应的过程、内源性刺激反应的过程。金荞麦优效组分的GO注释图见图1。

2.5 优效组分-靶点蛋白-信号通路网络图的构建结果

利用Cytoscape 3.5.1软件构建“金荞麦优效组分-靶点蛋白-信号通路”网络图，节点分别表示金荞麦优效组分、靶点蛋白编号以及信号通路，边分别表示金荞麦优效组分与靶点蛋白、信号通路与靶点蛋白之间的相互联系，结果见图2。

由图2可知，优效组分-靶点蛋白-信号通路网络图中共有163个节点、531条边。Degree值越大该节点在该网络图中发挥的作用越大，因此笔者取Degree值排前10位的靶点蛋白及信号通路进行分析，结果见表4。

表4 Degree值排前10位的靶点蛋白及信号通路

由表4可知，HRAS基因编码的GTP酶（P01112）、糖原合成酶激酶3（P31751）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（P31749）、雌二醇17-β-脱氢酶1（P14061）、双特异性MAPK1（Q02750）、Ras相关的C3肉毒杆菌毒素底物1（P63000）、3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（O15530）、cAMP特异性3，5-环磷酸二酯酶4D（Q08499）、维生素D3受体（P11473）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src（P12931）等靶点蛋白可能是金荞麦优效组分发挥作用的潜在靶点;主要涉及前列腺癌通路、黑色素瘤通路、非小细胞肺癌通路、胰岛素信号通路、MAPK信号通路、VEGF信号通路等。

3 讨论

本研究运用网络药理学筛选出金荞麦中的优效组分，并分析得到絲氨酸/苏氨酸-蛋白激酶、HRAS基因编码的GTP酶、双特异性MAPK1等重要的靶点蛋白，其主要涉及的信号通路包括前列腺癌通路、黑色素瘤通路、非小细胞肺癌通路、胰岛素信号通路、MAPK信号通路、VEGF信号通路等。

抗肿瘤是金荞麦优效组分的重要药理作用，本研究发现，金荞麦优效组分如槲皮素、异鼠李素、木犀草素、儿茶素类以及β-谷甾醇可能是其发挥抗肿瘤作用的关键成分。现代研究发现，槲皮素通过外部及内部2种途径激活胱天蛋白酶（Caspase）酶系、导致细胞色素C的释放、PARP的裂解，使肿瘤细胞如乳腺癌MCF-7细胞和鼻咽癌CNE2、HK1细胞发生凋亡[10-11];且槲皮素作用于癌细胞后可抑制基质金属蛋白酶（MMPs）、VEGF、表皮生长因子（EGF）等的活性，从而抑制肿瘤细胞的血管生成和转移[12]。异鼠李素通过活性氧（ROS）依赖性凋亡途径，呈剂量依赖性地抑制乳腺癌MCF-7细胞的活性[13];也可以上调促凋亡蛋白B淋巴细胞瘤2相关的X蛋白（Bax）、Caspase-3的表达，下调抑凋亡蛋白B淋巴细胞瘤2（Bcl-2）、G1/S-特异性周期蛋白D1（cyclinD1）和增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白的表达，诱导肺癌A549细胞凋亡[14]。木犀草素可以通过激活氨基末端激酶（JNK）直接诱导细胞凋亡[15]。儿茶素类通过抑制促血管生成因子，抑制肿瘤血管的生成，从而抑制癌细胞的侵袭[16]。β-谷甾醇也是一种有效的抗癌成分，在结直肠癌细胞和白血病细胞中能有效地诱导肿瘤细胞发生凋亡，产生良好的抗肿瘤效果[17-18]。上述文献报道的结果与本文的网络药理学分析结果相同，并且其抗癌的分子机制可能是通过HRAS基因编码的GTP酶、Caspase-3酶、双特异性MAPK1等，作用于MAPK信号通路、VEGF信号通路，从而发挥其抗肿瘤作用。

抗炎作用是金荞麦表现出的另一个重要的药理作用。相关研究发现，金荞麦的提取物可降低干扰素γ、趋化因子受体3、降钙素、白细胞介素和白三烯的含量，从而减轻慢性阻塞性肺炎模型大鼠的炎症反应[19];金荞麦的乙醇浸膏也可明显减轻关节炎模型大鼠的多发性关节炎症状[20]。也有研究证明，原矢车菊素B1可以调控MAPK信号，通过对蛋白的磷酸化调控，可显著抑制免疫细胞中细胞外调节蛋白激酶（ERK）、JNK和蛋白激酶p38的磷酸化，MAPK的活化导致转录激活因子（AP-1）活性的降低，从而抑制促炎因子的产生[21]。本研究发现，金荞麦可能是通过趋化因子通路、FcεRI信号通路及MAPK信号通路抑制炎症介质的产生，从而发挥抗炎作用。

另外，抗氧化、调节糖脂代谢在预防心血管疾病中也至关重要。有相关研究表明，金荞麦茶可降低2型糖尿病模型小鼠的空腹血糖、总胆固醇、三酰甘油，改善其糖脂代谢[22]。据报道，槲皮素有抗糖尿病的潜力，其作用机制涉及抑制肠葡萄糖吸收、胰岛素分泌和胰岛素敏化活性以及改善外周组织中的葡萄糖利用等[23]。由于儿茶素类化合物具有的特殊结构（邻苯二羟基或邻苯三羟基）可清除有害的自由基，或与金属离子发生鳌合反应，因而具有极强的抗氧化特性[24]。据报道，儿茶素类可直接消除细胞中的ROS或间接抑制促氧化酶的活性，并产生抗氧化酶，从而抑制氧化应激反应[16]。通过本研究也发现，金荞麦可能通过胰岛素信号通路、PPAR信号通路调节糖脂代谢。

综上，本研究利用网络药理学对金荞麦优效组分及其信号通路、作用机制进行了初步的筛选和分析，可为后续金荞麦组分的作用机制研究提供依据，并对金荞麦的深入开发利用提供前期研究基础。

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（收稿日期：2019-08-19 修回日期：2019-12-12）

（编辑：唐晓莲）