响应面法优化辣木籽蛋白质提取工艺的研究

唐诗琦，刘小玲，林 莹，白聪豪，符 珍

(广西大学轻工与食品工程学院，广西 南宁 530004)

辣木(Moringa)又称“鼓槌树”，原产于热带和南亚热带地区的印度北部[1]。19世纪末，我国云南省已经引入种植辣木[2]。目前开发利用最多的是印度传统辣木[3]，对其研究主要集中在动物饲料、净水功能、化妆品添加剂、功能性食品、食用油等[4-6]。

辣木籽作为辣木相关衍生产物，其营养成分极其丰富，含有大量的脂肪、蛋白质、矿物元素和膳食纤维[7-8]，被誉为“植物钻石”。在东南亚国家，辣木籽作为民间传统药物用于预防和治疗多种疾病，如心脑血管疾病、胃溃疡和糖尿病等[9-11]。目前对辣木籽的研究多为医学临床应用[12]、辣木籽多糖的提取[13]、水酶法和甲醇法提取辣木籽中的油脂和蛋白质[14]、辣木籽蛋白质对水浊度的影响等[15-17]，但对分离提取辣木籽蛋白质相关研究较少。段琼芬等人[18]研究表明，辣木籽蛋白质质量分数高达37%，与大豆蛋白质含量相接近，辣木籽蛋白质提取利用范围极大，常采用盐溶提取法和水酶法对辣木籽蛋白质进行提取研究[19-20]，但这2种提取方法对蛋白质结构以及性质影响较大，蛋白质极易变性。

较现有提取辣木籽蛋白质方法相比，本试验采用超声波辅助碱法提取辣木籽蛋白质,并采用响应面法对提取工艺优化，降低蛋白质变性程度；将提取的辣木籽粗蛋白质进行初步纯化，采用SDS-PAGE电泳技术分析其分子量分布范围，以期为辣木籽蛋白质的进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

辣木籽,市售，粉碎后过80目筛；牛血清蛋白,BIOFROX公司；盐酸体积分数36%～38%，优级纯；考马斯亮蓝G-250、氢氧化钠、冰醋酸等,均为国产分析纯。

722N可见分光光度计,上海仪电科学仪器股份有限公司；JAC-300N型数控超声波清洗仪,山东省济宁市奥波超声电气有限公司；SKD-2000凯氏定氮仪,上海沛欧分析仪器有限公司；SZF-06A脂肪测定仪,上海新嘉电子有限公司；CR21N高速冷冻离心机,日本Himac公司；FD-1D-50冷冻干燥机,北京博医康实验仪器有限公司；041BR95359电泳仪,BIO RAD公司；ChemiDoc MP System化学发光荧光成像系统,BIO RAD公司；L-8900高速全自动氨基酸分析仪,日本Hitachi公司。

1.2 试验方法

1.2.1基本成分的测定

测定辣木籽水分、蛋白质、脂肪、黄酮和灰分。水分按照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》中直接干燥法测定；蛋白质按照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法测定；脂肪按照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》中索氏抽提法测定；黄酮按照NY/T 1295—2007《荞麦及其制品中总黄酮含量的测定》测定；灰分按照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》中质量法测定。

1.2.2牛血清蛋白标准曲线的制备

采用Bradford[21]的方法进行蛋白质定量。取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 ml，浓度为0.1 mg/ml的蛋白质标准溶液并补至1.00 ml，加入5.00 ml考马斯亮蓝。在波长为595 nm处测定吸光度值，绘制标准曲线。线性回归方程y=3.649 1x+0.016，R2=0.996 1，线性关系较好。

1.2.3辣木籽蛋白质提取工艺流程

新鲜辣木籽→粉碎→过筛(80目)→正己烷脱脂→晾干→脱脂辣木籽→提取→离心(8 000 r/min，4℃，20 min)→取上清液→二次提取→离心(8 000 r/min，4℃，15 min)→取上清液→合并2次粗提液→等电点沉淀→离心(8 000 r/min，4℃，15 min)→取沉淀，透析→冷冻干燥→辣木籽蛋白粉。

1.2.4辣木籽蛋白质提取率的测定

采用1.2.2节中Bradford的方法，精密移取0.02 ml辣木籽蛋白质提取液于试管中，补至1.00 ml，加入5.00 ml考马斯亮蓝溶液，于波长595 nm下测定吸光度值。由所测得的蛋白质标准曲线计算辣木籽蛋白质含量，其中蛋白质总含量采用1.2.1节中凯氏定氮法测定脱脂后辣木籽蛋白质质量分数为55.24%，根据公式(1)计算辣木籽蛋白质提取率。

(1)

1.2.5单因素试验

每组单因素试验分别称取2.00 g脱脂辣木籽粉末，并采用相同方法重复提取2次。考察固液比、pH值、提取时间、提取温度和超声功率5个因素对辣木籽蛋白质提取率的影响，并选择最佳因素水平进行响应面试验。

1.2.6响应面法优化试验

以提取辣木籽蛋白的单因素试验结果为依据，影响辣木籽蛋白质提取率较大的pH值、提取时间、提取温度、超声功率为试验因素，辣木籽蛋白质提取率为响应值，建立四因素三水平以Box-Benhnken为原理的中心组合试验。响应面法试验因素水平编码见表1。

表1 响应面法试验因素水平编码表

1.2.7辣木籽蛋白质等电点测定

在辣木籽蛋白质提取工艺最佳条件情况下测定辣木籽蛋白质等电点。pH值处于蛋白质等电点时，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀，其溶解度达到最低点并保持天然构象[22]。取辣木籽蛋白质粗提液25 ml，将粗提液pH值分别调至2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8，静置2.0 h，以转速8 000 r/min、温度4℃ 离心15 min，取上清液。采用1.2.4节中Bradford的方法测量上清液吸光度值，计算上清液蛋白质质量分数，同时以空白试剂为参照。

将等电点沉淀后的蛋白质粗提液离心，弃上清液，取沉淀透析36 h，将透析液冷冻干燥，得到辣木籽蛋白粉。辣木籽蛋白质沉淀率根据公式(2)计算。其辣木籽蛋白纯度按照1.2.1中凯氏定氮法测量。

(2)

1.2.8SDS-PAGE电泳

取适量辣木籽蛋白粉加入一定比例的尿素和5倍样品缓冲液，使用12%分离胶和5%浓缩胶，Marker上样量为5 μl，辣木籽蛋白上样量为10 μl，浓缩胶和分离胶电压分别为80 V和120 V。电泳结束后取出凝胶片，考马斯亮蓝G-250染色液染色1.0 h，脱色至条带清晰后使用荧光成像系统对凝胶片图像采集成像[23]。

1.2.9氨基酸组分测定及计算分析

取300 mg脱脂辣木籽粉末加入10.00 ml 6 mol/L HCl于水解管中冷冻10 min，取出后于110℃烘箱中水解22 h。水解完毕取出冷却，过滤定容至50 ml。取1.00 ml滤液移入100 ml烧杯中，于60℃水浴蒸发干燥，加水1.00 ml重复干燥3次至酸挥发完全。加入0.02 mol/L HCl冲洗并定容至10 ml，以0.22 μm水系滤膜过滤至进样瓶中待测。检测样品进样量为20 μl，仪器运行压力30 kPa，氮气压力0.06～0.1 MPa。样品中的氨基酸含量依照标准GB 5009.124—2016计算。

1.3 试验数据处理

以上试验均重复测量3次，以保证试验值的精确度。试验分析采用统计分析软件Design-expert8.0对数据进行响应面分析，SPSS20.0进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 辣木籽基本组成成分分析

辣木籽基本成分如表2所示，其中辣木籽蛋白质质量分数为35.48%±0.16%。常鑫[24]测得我国70种大豆蛋白质质量分数为34.46%～45.13%，平均值为40.17%，李若姝等人[25]测得我国黑龙江和吉林两省53种大豆蛋白质质量分数平均值为40.57%。由此可知，辣木籽蛋白质含量较高，与大豆蛋白质含量相接近，有极大的研究价值。

表2 辣木籽基本成分含量

2.2 单因素试验

2.2.1固液比对辣木籽蛋白质提取率的影响

在提取温度45℃，提取时间45 min，pH 8.5，超声功率180 W，固液比分别在1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35的条件下提取辣木籽蛋白，结果如图1所示。固液比1∶15～1∶35时辣木籽蛋白质提取率随溶剂量的增大呈先增大后减小趋势，并且在固液比为1∶25时蛋白质提取率达到最大值42.92%±0.9%。这是因为当溶剂较少时，辣木籽与溶剂接触面积较小结合不充分，辣木籽蛋白质不能充分溶出[26]。固液比在1∶20～1∶30时无显著性差异，均在42%左右，为了减小后续分离纯化的不便，选择1∶25作为辣木籽蛋白质提取的最佳固液比，并且不作为响应面优化试验的条件因素之一。

图1 固液比对辣木籽蛋白质提取率的影响

2.2.2pH值对辣木籽蛋白提取率的影响

在固液比1∶25，提取温度45℃，提取时间45 min，超声功率180 W，pH值分别在6、7、8、9、10的条件下提取辣木籽蛋白质，结果如图2所示。pH值在6.0～10.0时，辣木籽蛋白质提取率呈现先上升后下降趋势，且当pH值为8.0时提取率最高为43.34%±0.76%。随着pH值的增大，反应体系中蛋白质分子携带的同种符号的净电荷增加并相互排斥，阻止了单个分子的聚集，因此溶解度增大[27]。但过高的pH值会影响辣木籽蛋白质聚集，促进发生美拉德反应[28]，并且pH值的变化使蛋白质提取率波动范围较大。综上所述，选择最佳提取pH 8.0，以有效的提取辣木籽蛋白质。

图2 pH值对辣木籽蛋白质提取率的影响

2.2.3提取时间对辣木籽蛋白质提取率的影响

在固液比1∶25，提取温度45℃，pH 8.5，超声功率180 W，提取时间分别在25、30、35、40、45、50、55 min的条件下提取辣木籽蛋白质，结果如图3所示。提取时间在25～45 min时，辣木籽蛋白质提取率随着超声时间增大而增大，增加趋势较陡；提取时间在45～55 min时，辣木籽蛋白质提取率随着超声时间增大而减小，降低趋势较缓慢。若提取时间较短，辣木籽与溶剂没有进行充分接触，辣木籽细胞破裂程度较小，导致辣木籽蛋白质不能充分溶出。提取时间过长会破坏维持辣木籽蛋白质结构的作用力[29]，使原来已析出的蛋白质分子与结合的水分子分离，最终导致蛋白质含量降低。

图3 提取时间对辣木籽蛋白质提取率的影响

2.2.4提取温度对辣木籽蛋白质提取率的影响

在固液比1∶25，提取时间45 min，pH 8.5，超声功率180 W，提取温度分别在35、40、45、50、55℃的条件下提取辣木籽蛋白质，结果如图4所示。提取温度对辣木籽蛋白质提取率影响较提取时间小，蛋白质提取率波动范围在40%～45%。辣木籽蛋白质提取率随着提取温度的升高先上升后下降。这是因为随着温度的逐步升高，蛋白质结构得以伸展，在适宜温度下可有效的提取辣木籽蛋白质。但温度过高会破坏蛋白质空间结构，使辣木籽蛋白质变性，改变其营养特性，降低辣木籽蛋白质的营养价值[30]。显著性差异分析表明组间存在显著性差异，综合考虑选择45℃为最佳提取温度。

图4 提取温度对辣木籽蛋白质提取率的影响

2.2.5超声功率对辣木籽蛋白质提取率的影响

在固液比1∶25，提取温度45℃，提取时间45 min，pH 8.5，超声功率分别为60、120、180、240、300W的条件下提取辣木籽蛋白质，结果如图5所示。随着超声功率的增大，辣木籽蛋白质提取率先上升后下降，超声功率在120 W时蛋白质提取率时为45.35%±0.88%。超声功率为60～120 W时提取率明显上升，因为超声波能够影响蛋白质结构和周围基团分布，使蛋白质结构变得松散，并且超声波能产生空化效应，增强辣木籽蛋白质间的能量传递，增加析出蛋白质浓度[31]。在120～300 W时提取率下降，这是因为随着超声功率增大，部分蛋白质分子能量传递成倍增大，相互作用力增大，导致空间结构被破坏，提取率降低。

图5 提取功率对辣木籽蛋白质提取率的影响

2.3 响应面法试验

2.3.1响应面法试验方案及结果

在响应面试验中以蛋白质提取率为响应值，pH值(A)、提取时间(B)、提取温度(C)、超声功率(D)为自变量，采用Box-Benhnken设计对辣木籽蛋白质提取工艺进行优化，试验方案与结果见表3。

表3 响应面法试验设计及蛋白质提取率

2.3.2响应面模型的建立与分析

根据Design-expert8.0对响应面模型进行拟合分析，得到二元回归方程：Y=45.21-0.24A-0.28B-0.26C+0.33D+0.25AB-0.35AC+0.57AD+1.46BC-0.47BD-0.62CD-0.66A2-3.00B2-1.81C2-1.35D2。由回归方程可知，A、B、C和D一次项系数的绝对值大小排列为D>B>C>A，则判断出各因素影响辣木籽蛋白提取率顺序为：超声功率>提取时间>提取温度>pH值。

对响应面回归模型进行方差分析，结果如表4所示。由表4可知，模型P<0.000 1，表明试验模型极显著，试验方法可靠；失拟项P=0.426 7(>0.05)，表明失拟项不显著，未知因素对试验影响较小。相关系数R2=0.960 6，模型预测值与真实试验值在试验范围内拟合度较好。BC、B2、C2、D2极显著，D、AD、CD、A2显著，表明提取功率对辣木籽蛋白提取率产生影响较大，其余因素及因素交互作用均不显著。

表4 回归模型方差分析

注：**为极显著(P<0.01)，*为显著(P<0.05)。

2.3.3响应曲面图分析

响应曲面图反映了不同试验因素的交互作用对辣木籽蛋白质提取率的影响[32]，详见图6。由图6(a)可知，提取时间比pH值曲面变化陡峭，曲面变化越陡峭说明对辣木籽蛋白质提取率影响越显著，并且观察等高线形状为椭圆形表明两因素的交互作用比较明显。同理，在图6(b～f)中，提取时间比提取温度对辣木籽蛋白提取率影响显著，提取温度比pH值对辣木籽蛋白质提取率影响显著，该结果与表4结果相同。a、d、e、f的等高线较b、c等高线更为密集，提取功率和提取时间较其他因素对辣木籽蛋白质提取率影响更加明显，其中d的等高线趋近于圆形，表明提取温度与提取时间之间交互作用最小，其他各因素间交互作用较大。

(a)提取时间与pH值

(b)提取温度与pH值

(c)超声功率与pH值

(d)提取温度与提取时间

(e)提取功率与提取时间

(f)超声功率与提取温度

2.3.4验证试验

为了进一步确定提取辣木籽蛋白质的最佳工艺条件，利用Design-expert 8.0继续分析，预测在pH 7.95、提取时间44.54 min、提取温度44.39℃、超声功率154.27 W的条件下，辣木籽蛋白质提取率达到最大值为45.275%。基于试验条件的考量，确定响应面优化试验条件为pH 8.0、提取时间45 min、提取温度44℃、超声功率150 W，进行3次平行试验以确保准确性。在该条件下辣木籽蛋白质实际提取率为(4.03±0.71)%，与预测值无显著性差异。因此响应面法优化辣木籽蛋白质的提取条件具有可行性。

2.4 辣木籽蛋白等电点测定结果分析

以辣木籽蛋白质质量浓度为纵坐标，pH值为横坐标，绘制辣木籽蛋白质含量与pH值关系图。由图7可知，辣木籽蛋白质质量浓度在pH 2.8～4.8时，先减少后增加，在pH值为3.4时，酸沉后上清液蛋白质质量浓度最低为2.64 mg/ml，沉淀率为54.27%。采用等电点沉淀后得到辣木籽蛋白质的纯度为91.31%。

图7 辣木籽蛋白质等电点测定

2.5 SDS-PAGE电泳分析

对照Marker来表达辣木籽蛋白质亚基分子量分布范围。图8表明辣木籽蛋白质分子量在14.4～180.0 kDa，主要含有16.0、25.0和45.0 kDa三个亚基，整体无明显杂带。非变性的辣木籽蛋白质在电泳过程中可以保持辣木籽蛋白质的高级结构和活性不变[33]。加入β-巯基乙醇后，辣木籽蛋白质亚基分开或消失，存在3条亚基条带，说明辣木籽蛋白质中含有二硫键。二硫键断裂后形成的亚基分子量较未加β-巯基乙醇时减小，在0～14.4、22.0和31.0～43.0 kDa均有分布。

2.6 氨基酸组成分析

辣木籽蛋白质各氨基酸组分含量及占总氨基酸比例详见表5。通过对辣木籽氨基酸的检测分析发现，辣木籽蛋白质中含有18种氨基酸，总量达到38.383 g/(100 g)。辣木籽蛋白质氨基酸组分中含有7种必需氨基酸，总量达到9.839 g/(100 g)，占总氨基酸含量的25.63%。谷氨酸可促进人体新陈代谢，在辣木籽所有氨基酸组分中含量最高，达到9.031 g/(100 g)。该结论与杨东顺等[34]研究结果相似。

泳道1：未加β-巯基乙醇的非还原SDS-PAGE电泳泳道2：加入β-巯基乙醇的还原SDS-PAGE电泳图8 辣木籽蛋白电泳图谱

表5 辣木籽氨基酸组分含量及占总氨基酸比例分析表

3 结论

(1)辣木籽的脂肪质量分数为41.14%，蛋白质质量分数为35.48%，水分为5.56%，黄酮质量分数为0.094%，灰分质量分数为5.12%。

(2)超声波辅助碱法提取辣木籽蛋白的最佳工艺为：pH 8.0、提取时间45 min、提取温度44℃、超声功率150W，所得辣木籽蛋白质提取率达到44.03%，各因素影响辣木籽蛋白提取率的顺序为：超声功率>提取时间>提取温度>pH值。

(3)辣木籽蛋白质等电点为3.4，在等电点条件下沉淀辣木籽蛋白质得到蛋白质沉淀率为54.27%，纯度达到91.31%；SDS-PAGE电泳分析表明辣木籽蛋白质主要含有3个亚基，其分子量分别为16.0、25.0和45.0 kDa。

(4)氨基酸分析表明辣木籽中含有18种氨基酸，有7种人体必需氨基酸，占总氨基酸含量的25.63%。谷氨酸含量最高达到9.031 g/(100g)，占比23.53%。辣木籽蛋白质作为一种优质的植物蛋白质资源，具有极大开发潜力