Box-Behnken响应面法优选光复凝胶的制备工艺及其药效学研究

李泽福，李越，齐梵琨

1.广州中医药大学 第三附属医院，广东 广州 510378；2.北京中医药大学，北京 102488；3.南方医科大学，广东 佛山 528300

皮肤老化可以分为内源性老化和外源性老化。皮肤作为全身的最大器官，日常生活中不能避免地会暴露在日光下，日光中的紫外线辐射是容易造成皮肤的外源性老化即光损伤。光损伤主要是由紫外线中的UVA和UVB引起的，紫外线可诱发氧化应激反应。皮肤暴露于紫外线下，细胞水平下活性氧簇(ROS)的增加会损害表皮和真皮细胞中的脂类、蛋白和核酸，从而会产生晒伤反应、皮肤光老化及光致癌效应。目前，臭氧层的破坏越来越严重，地面紫外线辐射强度越来越大，光损伤皮肤病也越来越多，因此，缓解和改善皮肤光损伤的研究成为了当前研究的热点之一。

本研究将广州中医药大学第三附属医院的临床经验方“光复膏”进一步研发，制备得到光复凝胶制剂，以便于更好地服务临床。“光复”由芦丁、枸杞子、绞股蓝等中药组成，在临床应用时，将中药原粉进行粉碎后，由凡士林作为基质，涂抹于受损皮肤，疗效确切，但具有药效成分溶出不完全、卫生不达标、涂抹用量较大及稳定性差等问题。因此，本课题组将光复膏进行剂型改造，制备成了光复凝胶[1]。不仅解决了上述问题，对小鼠急性皮肤损伤有较好的治疗作用，也提高了生物利用度和患者的依从性，具有一定的临床参考价值，也为剂型的开发和改造提供了依据。

1 材料

1.1 仪器

粉碎机(永康市铂欧五金制品有限公司，型号：800Y)；药筛(DOLO，型号：DL-248)；脱毛器(Riwa，型号：RF-770A)；电热恒温水浴锅(林茂科技有限公司)；恒温磁力搅拌器(LICHEN，型号：DF-101)、313 nm UVB 灯管(冠鸿睿，型号：UVB-313)；G16型医用高速离心机(白洋离心机厂)；T10 basic S25 型手持匀浆机(德国IKA公司)；大龙TopPette移液器(北京大龙兴创实验仪器有限公司)；WD-2102A型全自动酶标仪(北京六一生物科技有限公司)。

1.2 试剂

磷酸缓冲液(批号：71010)、铁氰化钾溶液(批号：11342)、氯乙酸溶液(批号：120221)、氯化铁溶液(批号：72032)、维生素C溶液(Vc,实验室配制)、盐酸(批号：11002)、冰醋酸(批号：11006)购自北京通广精细化工有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(批号：R22261)、丙二醛试剂盒(批号：R21869)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒(批号：R21877)、过氧化氢酶(CAT)试剂盒(批号：R21885)购自上海源叶生物科技有限公司。

1.3 动物

SPF级昆明种小鼠，雌性[5周龄，体质量(20±2)g，合格证号 SCXK(京)2018-0002，购于北京斯贝福实验动物科技有限公司]。

2 方法与结果

2.1 中药原液的提取与浓缩

取适量中药细粉与辅料麸皮按比例混合均匀后灭菌备用，接种5%绿色木霉，于一定温度下培养。

2.2 铁离子还原能力测定

抗氧化剂(还原剂)是通过自身的还原作用，给出电子而清除自由基的。还原能力越强，抗氧化性越强，实验中样品的抗氧化性能使铁氰化钾的三价铁还原成二价铁(亚铁氰化钾)，二价铁进一步在和氯化铁的反应下生成在700 nm处有最大吸收光度的普鲁士蓝，因此测定700 nm处吸光度的高低，可以代表抗氧化剂的还原能力，其吸光度和还原能力呈正相关。

测定铁离子还原能力具体操作如下[2]：将提取液浓缩干燥，配置成不同浓度梯度的样品溶液，依次加入一定量磷酸缓冲液、铁氰化钾溶液，混合均匀，将该体系置于50 ℃的水浴中反应20 min，取出后迅速冷却，加入三氯乙酸溶液，离心10 min 后取上清液再加入蒸馏水和一定浓度的氯化铁溶液，混匀后反应继续10 min，测定其在波长700 nm处的吸光度，实验重复3次。另以Vc溶液为标准对照，测定不同质量浓度下Vc反应的吸光度，将Vc质量浓度作为自变量，吸光度作为因变量绘制标准曲线，其线性回归方程为Y=0.898X+0.009，r=0.998。样品还原Fe3+能力用Vc抗氧化当量(AEAC,mg·mL-1)表示。

2.3 Box-Behnken响应面法优选中药原液的提取工艺

2.3.1设计及结果 本实验将中药细粉与辅料麸皮质量比A，培养温度B和培养时间C作为3个考察因素，以Vc抗氧化当量为评价指标，优化中药原液的提取工艺。每个因素选取低、中、高3个水平，设计因素水平见表1，具体实验设计和实验结果见表2。

表1 中药原液提取工艺优化的设计实验因素与水平

表2 Box-Behnken响应面法优选制备工艺实验设计及其结果

2.3.2模型拟合 采用Design-Expert对上述数据进行分析，以Y拟合自变量模型，得到二次多项式回归方程Y=21.34+8.36A-10.29B+12.02C-2.24AB+6.48AC-1.65BC+1.59A2+5.01B2+3.10C2，P<0.01，F=448.86，表明模型项显著；失拟项P=0.186 5>0.05，失拟项不显著，说明该模型拟合度和可信度均有效，建模成功；r=0.998 3，接近1，说明该模型实际值与预测值拟合性较高，可以用其进行预测。此外，由F检验可知3个因素对AEAC的影响按主次排位顺序为C>B>A，这3种因素对AEAC的影响都极显著，且交互作用显著,具体结果见表3。

2.3.3响应面优化分析 根据拟合方程，通过Design-Expert V8.0.6.1软件绘制评价指标Vc抗氧化当量随因素变化的等高线图和响应面图，见图1。

由图lA可知，在一定范围内，药液的抗氧化能力随着温度的降低而增加；图1B可知，药辅比一定时，药液的抗氧化能力随着培养时间的延长而升高，当药辅比为3∶2时达到最高；由图lC可知，当培养时间一定时，药液的抗氧化能力随着温度的升高而降低。响应曲面的结果表明，当药辅比一定时，在较长的培养时间和较低的培养温度下药液的抗氧化能力较好。

表3 光复凝胶制备工艺方差分析

根据回归模型分析可知，中药原液的最优制备条件为：药辅比为2.31∶1.54，培养温度为27.9 ℃，培养4.35 d。按照优化的条件，考虑实际操作的可行性，各因素值保留为整数，药辅比为3∶2，培养温度为30 ℃，培养5 d。

2.4 光复凝胶的制备

取处方量中药细粉与辅料麸皮按3∶2混匀后灭菌备用，接种5% 绿色木霉，于30 ℃ 培养5 d，加入75% 乙醇于80 ℃ 提取90 min，收集上清液，定容，备用。羟丙基甲基纤维素(HPMC)中注入蒸馏水(5%)，使其充分润湿并分散，4 ℃冰箱放置24 h使其充分溶胀；溶胀后，依次加入溶解有处方量冰片的丙二醇和中药提取浓缩液，边加边搅拌，搅拌均匀，即得。

注：A.药材细粉与辅料麸皮质量比;B.培养温度;C.培养时间。图1 各因素交互作用对ACAE影响的响应面图和等高线图

2.5 药效学研究

2.5.1光复凝胶对小鼠皮肤急性损伤后体质量及皮肤外观的影响

2.5.1.1动物分组 空白对照组(A)、模型组(B)、基质组(C)、光复凝胶低剂量组(D)、光复凝胶中剂量组(E)和光复凝胶高剂量组(F)，每组10 只小鼠，并脱去小鼠背部的毛，脱毛范围(2 cm×2 cm)。

2.5.1.2建立小鼠皮肤紫外损伤模型 开启紫外线灯[3]，预热15 min，照射灯光源距小鼠背部25 cm，辐照剂量为0.56 w·cm-2，每天照射2 h，连续照射2 周，此时小鼠皮肤肉眼可见表现出变红、起皮，局部有红疹、溃烂、有皮革样触感，即为造模成功[4-5]。除正常对照组之外，各光照组动物均置于鼠笼内，照射前15 min各组分别涂抹凝胶基质，光复凝胶低、中、高剂量，载提取液分别对应药材/凝胶2、3、4 g·mL-1，涂抹量为每只小鼠每次2 mg·cm-2。

2.5.1.3光复凝胶对小鼠皮肤急性损伤后体质量及外观的影响 照射前每隔2 d称体质量1次，观察小鼠体质量变化趋势。每天观察小鼠背部皮肤变化，第14天根据评分标准进行评分，具体评分标准[6]见表4。具体结果见图2和表5。

表4 小鼠背部 UVB 照射区域皮肤损伤状况评分标准

图2 小鼠体质量变化趋势

表5 各组小鼠皮肤外观状态评分结果

注：与空白组相比，*P<0.05,**P<0.001;与紫外模型组相比，#P<0.05，##P<0.01，下同。

实验结果表明，空白对照组的小鼠体质量涨幅为36.55%，以此为参照，模型组与空白组的涨幅分别为16.21%和16.33%，光复凝胶低、中、高剂量组涨幅分别28.58%、30.36%和30.42%，说明该模型影响小鼠正常发育，给药组小鼠体质量比不给药组小鼠的体质量增长快，即光复凝胶对小鼠状态恢复有良好的影响。除此之外，实验结果表明，长期中、长波紫外线照射可引起昆明小鼠背部皮肤的光老化，如粗糙及皱纹(P<0.01)，在照射前外敷光复凝胶对紫外线有一定防护作用，且光复凝胶剂量越高，越能改善中、长波紫外线所致的昆明小鼠皮肤粗糙、脱屑及皱纹等光老化外观状态(P<0.01)，而基质软膏则无此作用。

2.5.2光复凝胶对小鼠损伤皮肤的抗氧化酶活性和丙二醛(MDA)含量的影响

2.5.2.1皮肤组织匀浆制备 取小鼠背部皮肤组织块，在0.9%氯化钠溶液中漂洗，除去血液，滤纸拭干称质量，放入5 mL烧杯中冰浴；取预冷的0.9%氯化钠溶液，将组织充分研磨制成10%的皮肤组织匀浆。将制备好的组织匀浆放入5 mL的离心管中以3000 r·min-1的速度离心15 min(离心半径：100 mm)，取上清液。

2.5.2.2测定皮肤组织中各项生化指标 严格按照试剂盒标准进行操作测量，实验结果见表6。

与正常对照组相比较，模型组皮肤组织中的SOD活性明显降低(P<0.01)；光复凝胶高剂量组与模型组相比较，小鼠皮肤组织中SOD表达明显增加(P<0.01)；低剂量组、基质组与模型组相比较，各数值差异无统计学意义(P>0.05)。与正常对照组相比较，模型组小鼠皮肤组织MDA表达明显增高(P<0.01)；光复凝胶低中高剂量组与模型组比较，小鼠皮肤组织中MDA表达明显减少(P<0.01)；基质组与模型组比较，各数值变化差异无统计学意义(P>0.05)。与正常对照组相比较，模型组小鼠皮肤组织GSH-Px酶活力明显降低(P<0.01)；光复凝胶中高剂量组与模型组比较，均能显著增加GSH-Px酶活力(P<0.01)；低剂量组与模型组比较，各数值变化差异无统计学意义(P>0.05)；基质组与模型组比较，各数值变化差异无统计学意义(P>0.05)。与正常对照组相比较，模型组小鼠皮肤组织CAT活性明显降低(P<0.01)；光复凝胶中高剂量组与模型组比较，小鼠皮肤组织中CAT活性都明显增高(P<0.01)；基质组与模型组比较，各数值变化差异无统计学意义(P>0.05)。

由以上结果可知优化后的光复凝胶可防止UVB辐照导致的皮肤损伤，其原因可能是通过提高皮肤组织内SOD，GSH-Px和CAT的活性，从而有效地清除皮肤组织自由基，使得皮肤自身抵抗紫外线的能力增强。

表6 小鼠背部皮肤组织中各项生化指标的活性

3 讨论

3.1 剂型的选择

凝胶剂是将药物加入至适宜的高分子材料凝胶基质中混匀，形成含有溶解、混悬或乳剂型状态的乳胶稠厚液体或澄清透明、均一稳定的半固体凝胶大分子网状体系[7-8]。作为一种新型透皮给药载体，凝胶能使有效成分以分子形式分散于大分子网络体系中，形成质地均匀细腻，具有良好生物相容性和稳定性的局部外用制剂[9-11]。本研究中选择的主要辅料为羟丙基甲基纤维素(hydroxypropyl methyl cellulose，HPMC)，其物理和化学性质优良，结构中的非离子型纤维素醚不带离子，亲水亲油基团和疏水基团的合理比例使其具有较好的与不同分了相互作用能力，是应用最多、范围最广的亲水凝胶骨架材料[12-13]。因此，本实验结合凝胶剂的优点，将膏剂改变剂型成以HPMC为主要材料的凝胶剂，获得了澄清透明、均匀细腻、涂展性良好且使用安全无刺激的光复凝胶，从而增加药物溶解度、提高生物利用度、增强抗紫外线能力，为进一步研究与开发透皮给药新剂型提供了依据。

3.2 优选方法的选择

响应面法是通过一系列确定性的试验，拟合一个响应面来模拟真实极限状态的曲面图。利用响应面设计试验，根据Box-Behnken的试验设计得到最优的考察因素和响应值来避免传统数理统计存在的问题，能够清晰明确地看出各因素之间的交互作用，除此之外，还能确定最佳实验条件并预测最佳值[14-17]。响应面法计算比较简便，是解决实际问题的有效手段。与正交试验相比，响应面法在优化实验条件过程中，能够通过中心组合实验设计对各个水平进行分析，结果精准、可靠，而正交试验只能对单个实验进行分析，数据可靠性较响应面法低。因此，本研究选择了Box-Behnken响应面法筛选光复凝胶的最优工艺。

3.3 生化指标的选择

SOD是生物体系中抗氧化酶系的重要组成成员，广泛分布在微生物、植物和动物体内。其具有特殊的生理活性，是清除生物体内自由基的主要物质。生物体中SOD的水平可以反映机体的衰老状况，现已证实，有60多种疾病是由氧自由基引起的。SOD还能抵抗和阻断氧自由基对细胞的损伤，及时修复受损细胞，恢复自由基对细胞的损伤。此外，SOD还可以通过过氧化作用攻击皮肤细胞中的脂质体，产生MDA，MDA可引起组织中的大分子交联反应，损害真皮组织。因此将SOD与MDA放在一起来评估皮肤组织氧化损伤的程度。GSH-Px，是体内清除过氧化氢和许多有机氢过氧化物的重要酶，通过催化谷胱甘肽使有毒的过氧化氢及脂质过氧化物还原为无毒的羟基化合物，从而保护细胞膜结构及功能不受过氧化物的损伤和干扰[18]，也是机体抗过氧化能力指标之一。

4 结论

本研究Box-Behnken响应面法优选出的光复凝胶质量稳定可控，制备工艺简便，为实际生产提供了理论依据。且通过药效实验证明光复凝胶可以通过提高皮肤组织内SOD、GSH-Px和CAT的活性，增强皮肤自身抵抗紫外线的能力，对小鼠急性皮肤损伤有较好的治疗作用，也为光复凝胶的临床应用提供了一定的参考价值。