多指标优化百合知母浓煎剂提取工艺△

陈丽，郑艳萍

1.江苏省中医院，江苏 南京 210029；2.南京海昌中药集团有限公司，江苏 南京 210061

百合知母汤[1]来源于汉代张仲景的《金匮要略》的古方，其方：百合七枚(劈)，知母三两(切)，先水洗百合，渍一宿，当白沫出，去其水，更以泉水二升，煎取一升，去滓，别以泉水二升。煎知母，取一升，去滓后会和，煎取一升五合，分温再服。

百合知母汤是中医的金方，是中药传承的精华，具有养阴安神，清热除烦之效。现代药理学研究表明，百合知母汤的黄酮类成分是治疗更年期综合征的有效成分之一[2]，其中芒果苷和新芒果苷是2个重要的黄酮类成分。百合是我们日常生活中常见的食疗药膳，药食同源从古至今一直盛传，现代药理研究表明，百合具有抗应激损伤、抗氧化、镇静催眠[3]、促进免疫[4]、降血糖[5]、绝经综合征[6]等药理作用。知母其总多糖有降血糖[7]、抗炎作用[8]等。知母的活性成分先抑制Na+-K+-ATP酶，目的是减少组织内耗氧量，达到减少内热的作用，通过提高实验小鼠的耐氧能力，达到减慢心律、降低血糖[9]的作用，其中生品知母抑制Na+-K+-ATP酶活性的作用较强，现代药理解释了传统中药理论知母的滋阴清热作用。因此本实验以芒果苷和总多糖为研究指标，采用L9(33)正交试验设计，系统研究了提取次数、加水倍数、提取时间3个因素对百合知母提取效果的影响，优选出最佳的提取工艺条件，为经典名方百合知母汤剂型改造和二次开发奠定了实验基础。

1 材料

1.1 仪器

Shimadzu LC-20AB高效液相色谱系统，包括在线脱气系统、自动进样器Prominence SIL-20A、二极管阵列检查器SPD-M20A、柱温箱CTO-20A(日本岛津有限公司)；RE-52旋转蒸发仪(瑞士步琪有限公司)；BS2242S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；KQ3200DB型数控超声仪(昆山市超声仪器有限公司)；UV-1800紫外-分光光度计(日本岛津有限公司)；TGL-16C离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.2 试药

芒果苷对照品(供含量检测用，批号：111607-200402)、D-无水葡萄糖对照品(供含量检测用，批号：110833-201205)均购自中国食品药品检定研究院，纯度均大于99.7%；乙醇、甲酸、硫酸、苯酚(分析纯，南京化学试剂有限公司)；乙腈(色谱纯，美国天地公司)；超纯水(南京海昌中药集团有限公司自制)。

百合产地湖南(批号：140721)、知母产地安徽(批号：141023)均来自南京海源中药饮片有限公司，经南京海源中药饮片公司丁菲中药师鉴定符合《中华人民共和国药典》2015年版一部百合、知母项下有关规定。

2 方法与结果

2.1 浓煎剂样品的制备

称取百合75 g、知母25 g置于2 L的圆底烧瓶中，加水浸泡30 min，置于电热套加热回流，烧开后保持微沸，开始计时，结束后过滤，滤渣加入圆底烧瓶中再按上面方法提取，合并所有提取药液，再将药渣充分压榨，压榨出的药汁并入上述药液，用旋转蒸发仪浓缩至为体积100 mL，即为百合知母汤的浓煎剂样品，置于4 ℃存放备用。

2.2 芒果苷的检测

2.2.1色谱条件 YMC-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：乙腈-0.2%甲酸水溶液，流速：1.0 mL·min-1，10%乙腈等度洗脱，检测波长：258 nm，进样量：10 μL，柱温：35 ℃，采样时间35 min。理论板数按芒果苷峰计算应不低于3000。

2.2.2溶液的制备 对照品溶液：取芒果苷对照品适量，精密称定0.95 mg，置10 mL的容量瓶中，加乙醇定容至刻度线，制成质量浓度为0.095 mg·mL-1的溶液备用。

供试品溶液：取百合知母汤浓煎剂样品1 mL，加入到10 mL的容量瓶中，用乙醇定容到刻度，充分摇匀后，50 ℃水浴热溶解30 min，静止10 min，用乙醇定容后，摇匀取上清液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3系统适应性试验 取2.2.2项下制备对照品溶液及供试品溶液，按2.2.1项下检测条件分析，进样量为10 μL，见图1。

注：A.对照品；B.供试品；C.空白溶剂；1.芒果苷。图1 百合知母汤浓煎剂HPLC图

2.2.4线性关系考察 精密吸取质量浓度为0.098 mg·mL-1芒果苷对照品溶液，用乙醇稀释，分别制成质量浓度为9.8、19.6、39.2、58.8、98 μg·mL-1对照品溶液，按照2.2.1的色谱条件进行测定，以峰面积(Y)和对照品质量浓度(X)进行回归，计算得回归方程：Y=4×107X+5681，r=0.999 7。说明芒果苷在9.8～98 μg·mL-1与峰面积成良好的线性关系。

2.2.5精密度试验 精密取2.2.2项下混合对照品溶液，按2.2.1项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积值，计算芒果苷峰面积的RSD为0.53%，说明分析设备精密度良好。

2.2.6重复性试验 取同批混合均匀的百合知母汤浓煎剂6份，按照2.2.2方法制备供试品溶液，按2.2.1色谱条件测定，记录各个色谱峰面积，计算芒果苷峰面积的RSD为1.66%，说明试验的分析方法重复性良好。

2.2.7稳定性试验 取同批混合均匀的百合知母汤浓煎剂供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样，按2.2.1色谱条件测定，记录各个色谱峰面积，计算芒果苷峰面积的RSD为1.76%，说明供试品溶液在24 h内稳定性较好。

2.2.8加样回收率试验 分别精密量取已知含量的同一批混合均匀的百合知母汤浓煎剂1 mL各6份，按照表1添加芒果苷对照品，按照2.2.2方法制备供试品溶液，按2.2.1色谱条件测定，测定峰面积，计算加样回收率，见表1。结果表明浓煎剂芒果苷回收率为99.71%，RSD为2.36%，加样回收率符合要求。

表1 百分别知母汤芒果苷加样回收率试验(n=6)

2.3 总多糖的含量测定

2.3.1标准曲线的制备 精密称取61.0 mgD-无水葡萄糖对照品置于100 mL容量瓶中，加纯化水定容，制成质量浓度为0.61 mg·mL-1的D-无水葡萄糖对照品溶液[10]。精密量取配置好的D-无水葡萄糖对照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分别置于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度线，摇匀，精密量取上述溶液2 mL，置具塞试管中，分别加入4%苯酚溶液1 mL，混匀，迅速加入硫酸7.0 mL，摇匀，于40 ℃水溶液中保温30 min，取出，置冰水浴中5 min，取出，以相应试剂为空白，照紫外-分光光度法，在490 nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标(Y)，浓度(X)为横坐标计算回归方程Y=47.845X-0.083 3，r=0.999 7，质量浓度为2.44～7.32 μg·mL-1线性关系良好。

2.3.2样品中总多糖的含量测定 精密量取百合知母汤浓煎剂，精密量取2 mL，加乙醇10 mL，搅拌，4000 r·min-1(离心半径为20 cm)离心10 min，去除上清液，取沉淀加水溶解，置50 mL容量瓶中，并稀释到刻度线，摇匀，精密量取2 mL，参照2.3.1项下D-无水葡萄糖标准曲线的制备方法，自“4%苯酚溶液1 mL”起制备，依法测定吸光度，按照标准曲线回归方程计算供试品总多糖含量(以葡萄糖计)。

2.4 百合知母汤浓煎剂正交试验

依据预试验单因素考察的结果，采用正交试验法对百合知母药材的提取工艺进行优选。以提取时间(A)、提取次数(B)、加水倍数(C)为考察因素，每个因素选取3个水平，百合知母汤提取工艺因素水平见表2。以百合知母中的2个活性成分芒果苷和总多糖的含量作为评价指标，综合评分总分为1，根据药效成分确定芒果苷和总多糖权重分别为0.5、0.5。在此基础上进行总加权评分，利用综合的评分值[11](W)对实验的结果进行分析：以各指标的最大值(Amax)作为参照对同一指标的各数据进行标准化处理，D表示实验中该指标成分测定值的标准化数据(D=A/Amax)结果见表3～4。

综合评分W=D芒果苷×0.5+D多糖×0.5

(1)

表2 百合知母汤提取因素水平

表3 百合知母汤提取正交试验

表4 百合知母汤提取正交试验方差分析

注：F0.05(2，2)=19.00；F0.01(2，2)=99.00。

从表3、4可以看出因素之间差异无统计学意义，表3结果表明：影响百合知母汤浓煎剂提取工艺的因素依次是B>A>C；进一步分析：提取次数因素各水平影响大小顺序为B3>B2>B1；提取时间因素各水平影响大小顺序为A3>A1>A2；加水倍数因素各水平影响大小顺序为C1>C2>C3；通过方差对比分析A、C对正交试验结果影响差异无统计学意义，所以以芒果苷的含量和多糖的含量综合评价得最佳的提取工艺为A3B3C1，但考虑节省时间选择A3B2C1，即提取时间3 h，提取次数2次，加水倍数10倍为最佳。

2.5 最佳提取工艺的验证实验

为进一步考察所选取工艺条件的可靠性及稳定性，按照原来的百合知母颗粒剂制备的处方扩大3倍称取3份，按照A3B2C1最优提取工艺进行验证实验，操作的方法同2.1，结果见表5。

表5 百合知母颗粒剂提取工艺验证

根据验证结果表明，正交试验设计得出的最佳提取工艺适合百合知母提取生产实践，方法具有可操作性。

3 讨论

3.1 水的用量

在本实验的预试验中分别加水8、10、12、14倍，发现随着加水量的增大，百合知母的提取液中芒果苷的含量先上升然后下降，说明水的使用在实际的生产中不能太多也不能太少，要适当，这样才能使百合知母汤剂有效成分最大限度提取出来。

3.2 流动相的选择

本实验流动相在参照《中华人民共和国药典》的方法做一些改动，《中华人民共和国药典》为乙腈-0.2%冰醋酸水溶液，实验中发现基线没有乙腈-0.2%甲酸水溶液稳，出峰尖。所以最后选定后者，且10%乙腈等度洗脱。

3.3 指标成分选取

本实验选择芒果苷和总多糖作为优化指标。芒果苷和新芒果苷是知母里面2个重要的黄酮类成分，其任何一个成分的含量高低均可间接反应知母药材的优劣[12]，考虑到实际生产中检验成本，只选用《中华人民共和国药典》中规定的知母检测指标芒果苷含量来反映知母药材优劣；百合中含有大量的百合多糖，同时也是百合主要的药效成分[4]，因此用总多糖来反映百合药材的优劣。百合知母汤中2味中药在本方中相互补充，因此在综合评分中各占50%来评价提取效果，保证百合知母浓煎剂的临床药效。

百合知母颗粒剂质量控制HPLC的检测指标只有1个芒果苷的含量，今后可以研究多项指标控制[12]，更大程度地控制百合知母颗粒剂的质量。